肺癌轉移瘤動物模型的建立

陳愉生，林小芬，李鴻茹，林獻，林明，許能鑾

(福建醫(yī)科大學省立臨床醫(yī)學院，福州 35001)

肺癌是世界上發(fā)生率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，轉移是肺癌死亡的主要原因，所以肺癌轉移的研究意義重大。利用免疫缺陷動物建立腫瘤動物模型，是研究腫瘤轉移機制的重要工具，國內外學者已經在這方面做了大量的探索[1，2]，理想的轉移模型卻并不多。本研究以人肺腺癌細胞A549為研究細胞，以BABL/c裸鼠為宿主動物，經尾靜脈注入人肺腺癌細胞，建立人肺腺癌實驗性轉移動物模型，為下一步的肺腺癌轉移機制的研究奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及實驗動物

人肺腺癌A549細胞株來源于中科院上海細胞研究所。SPF級BALB/c裸鼠11只，4～6周齡，體重(16±2) g，雌雄各半，購于中國科學院上海實驗動物中心【SCXK(滬)2012-002】，飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學動物實驗中心SPF級動物室【SYXK(閩)2012-0001】，所用的飼料、水、墊料都經過嚴格滅菌處理，并按動物實驗的3R原則給予人道的關懷。

1.1.2 主要試劑與設備

RPMI 1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶2-EDTA(Hyclone公司，美國)、胎牛血清(杭州四季青公司，中國)、生物安全柜和CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司，日本)、倒置顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，將A549細胞培養(yǎng)于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。取對數(shù)生長期細胞, 經胰酶消化制備細胞懸液，以1000 r/min離心5 min，棄去上清液。加入無血清的1640培養(yǎng)基，再經吹打、離心。以無血清培養(yǎng)基重懸制備單細胞懸液。

1.2.2 細胞計數(shù)

吹打混勻細胞, 取4滴細胞懸液、4滴臺盼藍染液混于離心管中，活細胞不被染。將混勻的細胞懸液滴入細胞計數(shù)板中, 統(tǒng)計四大格的活細胞及死細胞數(shù)，細胞量/mL=(四大方格細胞總數(shù)/ 4)× 104× 2/mL。臺盼藍染色示細胞存活率>90%(細胞存活率=活細胞數(shù)/細胞總數(shù) × 100%)。離心并重懸細胞至密度為1×107個/ mL。

1.2.3 細胞接種

通過剪裸鼠耳朵標記裸鼠的左耳上下、右耳上下部位。在SPF級動物房，將裸鼠固定在固鼠器內，壓住鼠尾巴根部，用酒精棉球擦拭尾巴消毒并擴張血管，用1 mL注射器吸取單細胞懸液，于尾部中外三分之一處進針，注意控制速度防止小鼠發(fā)生栓塞。每只0.1 mL，即1×106個。

1.2.4 肺部及全身其他臟器的轉移情況

分別于接種腫瘤細胞后第4、5、6、7周，用頸椎脫臼法隨機處死2只，余3只出現(xiàn)惡液質時處死。解剖小鼠，觀察肺、淋巴結、腦、肝、腎等臟器有無轉移灶，計算肺部轉移的結節(jié)數(shù)。

1.2.5 肺部轉移病灶的病理檢查

對肺部轉移灶行病理取材，置于4%甲醛固定, 固定24 h后, 制成石蠟切片, HE染色，鏡下觀察。

2 結果

2.1 接種后裸鼠的一般情況

尾靜脈注射過程中，11只裸鼠均未見死亡，精神狀態(tài)好，反應靈敏。未處死的3只，分別于接種后第11、13、14周出現(xiàn)惡液質。

2.2 小鼠解剖后肺部及其他臟器轉移情況

第4周未出現(xiàn)轉移結節(jié)；第5周出現(xiàn)鏡下轉移結節(jié)；第6周出現(xiàn)肉眼轉移結節(jié)，平均15個；第7周轉移結節(jié)數(shù)目明顯增多，平均30個；第11、13、14周的肺部呈彌漫性病變，肺質地堅韌。肺部的轉移結節(jié)呈半透明樣，切開呈實性(彩圖1，見彩插6，圖2見彩插7)。其他臟器在第11周縱隔淋巴結有轉移灶(見彩圖3A,彩插7)，其余小鼠均未見其他臟器的轉移灶，亦未見胸水。

2.3 肺轉移灶的病理檢查結果

轉移灶細胞呈腺樣排列。細胞呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形，分化差，核大，深染，核質比大，核分裂相多見，符合腺癌病理特點(見彩圖3B,彩插7)。

3 討論

建立一種比較理想的肺癌轉移模型，對于進一步研究肺癌轉移分子機制、研究肺癌轉移細胞的生物學特性、肺癌遠處轉移的基因治療等方面意義重大。

實驗動物模型建立成功與否主要取決于以下幾個方面：①腫瘤細胞接種部位。②接種細胞的數(shù)量及狀態(tài)。③實驗動物的選擇。

目前存在的腫瘤轉移模型形式多樣，主要分為自發(fā)性轉移模型和實驗性轉移模型，前者包括皮下接種、原位接種，后者為循環(huán)系統(tǒng)接種。

皮下接種轉移模型國內外學者[3，4]均有報道，該模型建立周期長，且不易出現(xiàn)轉移。腫瘤在小鼠體內出現(xiàn)轉移需要的周期長，常于未出現(xiàn)轉移時，負荷的腫瘤出現(xiàn)破潰，或腫瘤負荷過重，小鼠出現(xiàn)惡液質，難以達到實驗要求[5]。

原位移植建立肺癌轉移模型漸漸成為熱點，學者們認為原位移植轉移模型能比較確切的模擬臨床轉移的過程。該模型成瘤率高，表現(xiàn)出較強的侵襲及轉移性[6]，但是原位移植存在一些不易實行的地方。小鼠的個體較小，4～6周齡，操作難度大；操作時必須嚴格遵守無菌原則，裸鼠為免疫缺陷動物，易發(fā)生術后感染甚至是死亡。此種模型安全性偏低，動物死亡率偏高。

本研究采用經尾靜脈注入肺腺癌細胞A549，建立肺癌實驗性轉移模型。實驗性轉移模型是指將瘤細胞懸液直接接種于血管腔內或淋巴管腔內建立的模型，這種方法的優(yōu)點是縮短了靶器官內形成瘤灶的時間，轉移率高；缺點是該模型模擬了腫瘤復雜轉移過程的一個階段，并不能模擬轉移的全過程。本研究中注入腫瘤細胞后第5周開始出現(xiàn)肺部轉移，肺部轉移率達11/11，與皮下注射腫瘤細胞相比，轉移率高且出現(xiàn)轉移的時間明顯縮短；本研究過程中未出現(xiàn)裸鼠死亡，未處死的3只裸鼠最早于注射腫瘤細胞后第11周出現(xiàn)惡液質，與原位移植相比，裸鼠不易出現(xiàn)感染，且存活時間長，有利于后續(xù)的研究。該模型特點是操作簡單、出現(xiàn)遠處轉移的時間短、轉移率高、動物存活率高及存活時間長。

種植的細胞數(shù)量及狀態(tài)會影響建模的成功與否。細胞接種過少，接種的成功率和自發(fā)轉移率都會減少；接種過多，又會引起腫瘤的失控生長，不利于后續(xù)的實驗。鄭井紅等[7]研究表明，接種細胞數(shù)過少未能形成肺轉移灶；接種細胞數(shù)量過大小鼠全部死亡。另外，接種的細胞一般取對數(shù)生長期的細胞，該期細胞生長活力高。參考有關文獻，本研究采用1×106個/只接種裸鼠尾靜脈，經臺盼藍染色，細胞活力達90%。通過分批處死裸鼠，動態(tài)觀察，肺部轉移率達100%，第7周轉移達到最高，符合既往文獻的報道[8]。

本研究選擇BABL/c裸鼠，因為它是無胸腺鼠，T細胞不能正常分化，所以對于異體物質沒有明顯的排斥反應，移植后腫瘤生長良好，也能保持腫瘤細胞原有形態(tài)及生物學特性，是腫瘤研究中較為常用的實驗動物[9]。BALB/c裸鼠為單一T細胞缺陷，NK細胞活性較高，B細胞仍參與免疫應答。而SCID小鼠為聯(lián)合免疫缺陷小鼠，T、B細胞聯(lián)合免疫缺陷，是人體異種移植較好的實驗動物。Bosma等[10]研究表明，SCID鼠在對人體腫瘤細胞系敏感性、成瘤率和轉移率方面都高于BALB/c 裸鼠。但是由于SCID裸鼠為聯(lián)合免疫缺陷裸鼠，價格昂貴，對于環(huán)境要求極高且不易飼養(yǎng)，死亡率較高。本研究持續(xù)時間長，為使結果具有統(tǒng)計學意義，盡量減少動物死亡數(shù)目，故本研究選擇BALB/c裸鼠。此外，裸鼠成瘤也受年齡影響。選取4～6周齡的裸鼠最佳。裸鼠體內T細胞會隨著年齡的增加而增加，相應的裸鼠的免疫功能增強, 移植成功率會受影響。綜合這幾方面的因素，本研究選擇了4～6周BALB/c裸鼠。

本研究中，接種1×106個/只到11只裸鼠尾靜脈。分別于接種后第4、5、6、7隨機處死2只，取肺部做HE染色觀察，第5周開始出現(xiàn)鏡下肺部轉移結節(jié)，第6周出現(xiàn)肉眼轉移結節(jié)，第7周轉移結節(jié)數(shù)增多。隨著接種周數(shù)的延長，肺部轉移結節(jié)的數(shù)目相應增多，符合腫瘤的生長規(guī)律。第11、13、14周肺部呈彌漫性病變，肺泡結構大量破壞，第11周出現(xiàn)淋巴結浸潤。生存時間較長，有利于腫瘤機制研究。本研究動態(tài)觀察腫瘤細胞的生長情況，更好反映肺腺癌在體內的轉移規(guī)律。但是，既往的文獻分批處死的動物數(shù)量一般較多[11]，本研究每批處死的2只，數(shù)量偏小，易引起假陰性。相關文獻報道，經尾靜脈注射其他腫瘤細胞建立肺部轉移模型，在肺部形成轉移結節(jié)的同時，其尾部注射部位也會形成腫瘤，但是本研究未出現(xiàn)尾部成瘤。

(本文圖1見彩插6,圖2,3見彩插7。)

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