牡丹皮抗子宮內(nèi)膜異位癥活性部位化學(xué)成分研究

張 偉， 王艷華， 吳德玲*， 王 權(quán)， 方成武，2， 程 璐

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 安徽 合肥 230031； 2.安徽省現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 安徽 合肥 230031；3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物化學(xué)研究所， 安徽 合肥 230031）

［成分分析］

牡丹皮抗子宮內(nèi)膜異位癥活性部位化學(xué)成分研究

張 偉1，2，3， 王艷華1， 吳德玲1，2，3*， 王 權(quán)1， 方成武1，2， 程 璐1

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 安徽 合肥 230031； 2.安徽省現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 安徽 合肥 230031；3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物化學(xué)研究所， 安徽 合肥 230031）

目的 研究牡丹皮抗子宮內(nèi)膜異位癥活性部位的化學(xué)成分。方法 運(yùn)用硅膠柱色譜、凝膠柱色譜及制備型液相色譜對(duì)抗子宮內(nèi)膜異位癥牡丹皮總苷乙酸乙酯的提取物進(jìn)行分離純化，根據(jù)化合物的理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)鑒定結(jié)構(gòu)。結(jié)果 從牡丹皮抗子宮內(nèi)膜異位癥活性部位中共分離鑒定了 8 個(gè)化合物， 分別為丹皮酚 （1）， 苯甲酸 （2）， β-谷甾醇 （3）， 2， 5-二羥基-4-甲基苯乙酮 （4）， 苯甲酰芍藥苷 （5）， 芍藥新苷 （6）， 芍藥苷 （7）， 氧化芍藥苷 （8）。 結(jié)論 化合物6為首次從該植物中分離得到。

牡丹皮；抗子宮內(nèi)膜異位癥；活性部位；化學(xué)成分

牡丹皮為芍藥科植物牡丹 Paeonia suffruticosa或鳳丹 Paeonia ostii.的干燥根皮［1］， 始載于 《 神農(nóng)本草經(jīng)》， 性微寒， 味辛、 苦， 歸心、 肝、 腎經(jīng)， 具有清熱涼血， 活血化瘀之功效［2］。 牡丹皮中主要含有酚及酚苷類、單萜及其苷類成分，其他還有三萜、甾醇及其苷類、黃酮、有機(jī)酸、香豆素等［3］； 其中丹皮酚、 丹皮總苷、 丹皮多糖等 為其主要 活 性 物 質(zhì)［4-5］。 現(xiàn) 代 研 究 證 實(shí) 牡 丹 皮 具 有 抗菌、抗炎、抗過敏及免疫調(diào)節(jié)、改善血液流變學(xué)等作用，是治療婦科疾病的常用要藥。課題組前期藥理研究中［6］發(fā)現(xiàn)丹皮不同提取物能明顯降低子宮內(nèi)膜異位癥模型動(dòng)物血清 IL-1、 IL-6 的水平， 減輕炎癥反應(yīng)，其中丹皮酚、丹皮總苷作用最為明顯；對(duì)血清 IL-1 水平下降排序?yàn)榈てざ嗵墙M ＜桂枝茯苓膠囊組＜丹皮總苷組＜丹皮酚組 ＜丹皮水提物組； 對(duì)血清 IL-6 水平下降排序?yàn)榈てざ嗵墙M ＜桂枝茯苓膠囊組＜丹皮總苷組＜丹皮水提物組＜丹皮酚組，桂枝茯苓膠囊組、丹皮水提物組、丹皮酚組、 丹皮總苷組與模型組相比有顯著性差異 （P＜0.05）。 為了更好地利用這一藥用資源， 因此以抗子宮內(nèi)膜異位癥作用為導(dǎo)向，對(duì)牡丹皮中抗子宮內(nèi)膜異位癥的活性部位丹皮總苷進(jìn)行了化學(xué)成分研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 AV-400 核磁共振儀 （ 德國 Bruker公司）； Dr Flash-S 系列中壓制備型液相色譜儀 （ 上海利穗科技有限公司）， 分離柱為 SepaFlash 預(yù)裝柱； WRS-IB數(shù)字熔點(diǎn)儀 （ 上海索光光電技術(shù)有限公司， 溫度未校正）； CP225D型十萬分之一電子天平 （德國賽多利斯）； RE-52A系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）； SHB-Ⅲ循環(huán)式多用真空泵 （鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）； ZF-2 型三用紫外儀 （上海安亭電子儀器廠）。

1.2 材料 柱色譜用硅膠 （100 ～200 目， 200 ～300 目）、 薄層色譜用硅膠 G、 GF254（ 青島海洋化工廠生產(chǎn)）； 凝膠 Sephadex LH-20 （50 μm， GE公司）；Rp-C18（50 μm， Merck 公司）； 乙醇為食用酒精；水為蒸餾水；其他試劑均為市售分析純。顯色劑為 5%香草醛-硫酸-乙醇溶液， 噴后 105 ℃加熱至顯色。

藥材采自安徽省銅陵市，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)中藥與資源教研室方成武教授鑒定為芍藥科植物鳳丹Paeonia ostii.的干燥根皮。

2 提取、 分離

牡丹皮藥材 7 kg， 按確定的提取、 富集工藝制備丹皮總苷部位［7］， 以乙酸乙酯進(jìn)行萃取，減壓回收溶劑得到乙酸乙酯部位 150 g， 丙酮溶解后拌樣， 三氯甲烷-甲 醇 （100 ∶0、 50 ∶1、 30 ∶1、10 ∶1、5 ∶1、 3 ∶1、 1 ∶1） 系統(tǒng)梯度洗脫， 經(jīng)TLC檢識(shí)， 合并相同 的流份。 在三氯 甲烷-甲醇（100 ∶0） 部分經(jīng)過反復(fù)硅膠柱色譜及重結(jié)晶得到化合物 1 （200 mg）， 在三氯甲烷-甲醇 （50 ∶1）部分經(jīng)過反復(fù)硅膠柱色譜、凝膠 Sephadex LH-20柱色譜得到化合物 2 （15 mg） 和化合物 3 （12 mg）， 在三氯甲烷-甲醇 （30 ∶1） 部分經(jīng)過反復(fù)硅膠柱色譜、 凝膠 Sephadex LH-20 柱色譜得到化合物 4 （11 mg），在三氯甲烷-甲醇 （10 ∶1）部分經(jīng)過反復(fù)硅膠柱色譜， 凝膠 SephadexLH-20 柱色譜，中壓制備液相， ODS 反相柱色譜得到化合物 5 （17 mg） 和化合物 6 （9 mg）， 在三氯甲烷-甲醇 （5 ∶1） 部分經(jīng)過反復(fù)硅膠柱色譜，凝膠 Sephadex LH-20 柱色譜，ODS 反相柱色譜得到化合 物 7 （42 mg） 和化合物 8 （18 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物 1： C9H10O3， mp 52 ～53 ℃，白色針狀晶體 （三氯甲烷）， 與三氯化鐵反應(yīng)顯紫紅色。TLC行為與丹皮酚對(duì)照品相同， 且 HPLC檢測(cè)色譜行為與已知對(duì)照品丹皮酚相同，確定化合物1為丹皮酚。

化合物 2： C7H6O2， mp 122 ～123 ℃， 白色結(jié)晶 （三氯甲烷-甲醇）， 易溶于甲醇、 三氯甲烷-甲醇的混合溶劑等。 TLC行為與苯甲酸對(duì)照品相同，且 HPLC檢測(cè)色譜行為與已知對(duì)照品苯甲酸相同，確定化合物2為苯甲酸。

化合物 3： C29H50O， 白色針狀晶體 （ 石油醚-乙酸乙酯） 。 Liebermann-Burchard 反 應(yīng)呈陽性。1HNMR （400 MHz， CDCl3） δ： 5.3 （1H， brs， H-6），3.52 （1H， m， H-3）， 1.25 （3H， s， Me-19）， 1.12（3H， d，Me-21）， 0.84 （3H，t， J=7.5 Hz， Me-29） ， 0.82 （ 3H， d， J=6.7 Hz， Me-26 ）， 0.79（3H， d， J=6.7 Hz， Me-27） 。 化合物 3 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］對(duì)照一致， TLC行為與 β-谷甾醇對(duì)照品相同， Rf值相同。 樣品與對(duì)照品混合物的熔點(diǎn)不下降， 確定該化合物結(jié)構(gòu)為 β-谷甾醇。

化合物 4：C9H10O3， 黃色針狀結(jié)晶 （石油醚-乙酸乙酯），易溶于三氯甲烷、乙酸乙酯、 三氯甲烷-甲醇的混合溶劑等。1H-NMR （400 MHz， CDCl3）δ： 11.84 （1H， s， 2-OH）， 7.10 （1H， s， H-3 ），6.77 （1H， s， H-6）， 4.54 （1H， s， 5-OH）， 2.54（3H， s， Ar-CH3）， 2.19 （3H， s， CH3） 。13C-NMR（100MHz， CDCl3） δ： 203.4 （C=O）， 156.8 （C-2）， 146.0 （ C-5 ）， 135.6 （ C-6 ） ， 120.0 （ C-1 ），117.6 （C-4）， 114.9 （ C-3 ）， 26.6 （C-9 ），16.6（C-8）。 化合物 4 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9-10］ 對(duì)照一致，確定該化合物結(jié)構(gòu)為 2，5-二羥基-4-甲基苯乙酮。

化合物 5： C30H32O12， mp 148 ～149 ℃，白色粉末 （ 三氯 甲 烷-甲 醇） ， Molish 反 應(yīng) 呈 陽性。1HNMR （400 MHz， CD3OD） δ： 7.97 （4H， m， H-2″，6″， 2?， 6?），7.54 （ 2H， t， H-4′， H-4?）， 7.41（4H， t， H-3″， 5″， 3?， 5?）， 5.31 （1H， s， H-9），4.50 （1H， d， J=8.0 Hz， H-Glc1′）， 2.44 （1H，d，J=4.2 Hz，H-5）， 2.43 （1H，m， H-5）， 2.40（1H， m， H-7β）， 1.77 （1H， d， J=12.8 Hz， H-3β）， 1.64 （ 1H， d， J=4.4 Hz， H-7β） ， 1.61（1H， d，J=6.8，H-3α），1.17 （3H， s，10-H）。13C-NMR （ 100 MHz， CD3OD） δ：168.0 （ C-7″），167.7 （ C-7?）， 134.6 （ C-4?）， 134.4 （ C-4″），131.4 （ C-1″）， 131.2 （ C-1?）， 130.7 （ C-2″），130.7 （ C-6″）， 130.6 （ C-2?）， 130.6 （ C-6?），129.7 （C-3″），129.7 （ C-5″）， 129.7 （ C-3?），129.7 （ C-5?）， 106.2 （ C-4 ） ， 102.3 （ C-9 ），100.1 （ C-1′）， 89.3 （ C-1 ） ， 87.1 （ C-2 ）， 77.9（ C-5′）， 75.2 （C-3′）， 75.0 （ C-2′），72.1 （ C-6）， 72.0 （C-4′），65.2 （C-6′）， 61.6 （C-8），44. 6 （ C-3）， 43.83 （ C-5 ） ， 23.0 （ C-7 ）， 19.4 （ C-10）。 化合物5 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］對(duì)照一致， 確定該化合物結(jié)構(gòu)為苯甲酰芍藥苷。

化合物 6：白色粉末 （甲醇）， 5%硫酸香草醛溶 液 顯 色 呈 藍(lán) 紫 色， ESI-MS 為 461 （ ［ MH］-）；1H-NMR （ 400 MHz， DMSO-d6） δ： 7.99（2H， d，J=8.0 Hz， H-2″， 6″）， 7.69 （1H， t， J= 8.0 Hz，H-4″）， 7.56 （2H， t， J=8.0 Hz， H-3″，5″）， 4.84 （1H， d， J=4.0 Hz， H-2） ， 4.71 （2H，s）， 4.49 （ 1H， d， J=8.0 Hz， H-Glc1′）， 2.44（1H， m， H-5）， 2.37 （1H， d， J=12.0 Hz， H-3β）， 2.08 （1H， dd， J=4.0 Hz， H-7α）， 1.40（3H， s， 10-H） 。13C-NMR（100 MHz， DMSO-d6） δ：216.6 （C-4）， 165.5 （C-7″）， 133.6 （C-4″）， 129. 2 （C-1″）， 129.1 （ C-2″， 6″），128.9 （C-3″， 5″），102.3 （ C-2 ）， 94.6 （ C-1′），84.7 （ C-1 ）， 79.5（ C-9 ）， 79.0 （ C-3′）， 74.9 （ C-2′）， 72.7 （ C-5′）， 70.5 （ C-4′）， 62.2 （ C-8 ）， 60.7 （ C-6′），54.9 （ C-6 ）， 47.1 （ C-3 ）， 36.8 （C-5 ），30.2（C-7）， 16.1 （C-10）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12-13］ 報(bào)道的芍藥新苷基本一致，確定該化合物6結(jié)構(gòu)為芍藥新苷。

化合物 7： C23H28O11， 白色粉末 （ 三氯甲烷-甲醇）， Molish 反應(yīng)呈陽性。 TLC行為與已知對(duì)照品芍藥苷相同， 且經(jīng) HPLC檢測(cè)保留時(shí)間與芍藥苷對(duì)照品相同，確定化合物7為芍藥苷。

化合物 8： C23H28O12， 白色粉末 （ 三氯甲烷-甲醇 ）， Molish 反 應(yīng) 呈 陽 性。1H-NMR （400 MHz，CD3OD） δ： 7.90 （2H， d J=8.0 Hz， H-2″， 6″），6.82 （2H， d， J=8.0 Hz， H-3″， 5″）， 5.38 （1H， s， H-9）， 4.67 （2H， s， H-8） ， 4.51 （1H， d， J= 8.0 Hz， H-Glc1′）， 2.55 （1H， d， J=6.4 Hz， 5-H）， 2.45 （1H， dd，J=4，8 Hz，7-Hα）， 2.17（1H， d，J=12.0 Hz， 3-Hα），1.92 （1H， d， J= 12.4 Hz， 7-Hβ）， 1.79 （1H， d， J=12.4 Hz， 3-Hβ）， 1.34 （3H， s， H-10）。13C-NMR （100 MHz，CD3OD）δ： 168.1 （ C-7″）， 163.8 （ C-4″）， 133.0（ C-2″， 6″），122.1 （ C-1″），116.3 （ C-3″， 5″），106.4 （C-4）， 102.4 （ C-9）， 100.2 （ C-1′）， 89.4（ C-1 ） ， 87.3 （ C-2 ）， 78.1 （ C-5′）， 78.0 （ C-3′）， 75.1 （ C-2′）， 72.4 （C-6 ）， 71.8 （C-4′），62.9 （ C-6′），61.3 （ C-8 ），44.6 （ C-3 ）， 44.0（C-5）， 23.5 （ C-7）， 19.6 （ C-10）。 化合物 8 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］對(duì)照一致， 確定該化合物結(jié)構(gòu)為氧化芍藥苷。

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Chem ical constituents of anti-endom etriosis active fraction from Moutan Cortex

ZHANGWei1，2，3， WANG Yan-hua1， WU De-ling1，2，3*， WANG Quan1， FANG Cheng-wu1，2，CHENG Lu1
（1.School of Pharmacy， AnhuiUniversity of ChineseMedicine， Hefei230031， China； 2.Anhui Provincial Key Lab of Contemporary Traditional Chinese Medicine， Hefei230031， China； 3.Institute of Pharmaceutical Chemistry， Anhui Academy of Chinese Medicine， Hefei230031， China）

AIM To study the chemical constituents of anti-endometriosis active fraction from Moutan Cortex. M ETHODS Ethyl acetate extracts of total glucosides from Moutan Cortex in treating endometriosis were isolated and purified by using the silica gel， Sephadex LH-20 and preparative liquid chromatographic separation methods，and structurally identified by physico-chemical properties and spectral analysis.RESULTS Eight constituents were obtained from anti-endometriosis active fraction of Moutan Cortex.Their structures were identified as paeonol（1）， benzoic acid （2） ， β-sitosterol（3）， 2，5-dihydroxy-4-methyl acetophenone（4）， benzoylpaeoniflorin （5），lactiflorin （6） ， paeoniflorin （ 7 ） ， oxypaeoniflorin （ 8 ） .CONCLUSION Compound 6 is first isolated from Moutan Cortex.

Moutan Cortex； anti-endometriosis； active fraction； chemical constituents

R284.1

： A

： 1001-1528（2014）01-0119-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.029

2013-02-17

國家支撐計(jì)劃項(xiàng)目 （2011BAI04B05）； 國家中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目 （201107009）； 康緣中醫(yī)藥科技創(chuàng)新基金 （KYCX201002）；安徽中醫(yī)學(xué)院青年科學(xué)研究基金 （2012qn019）

張 偉 （1985—）， 男， 助教， 從事中藥活性成分及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化研究。

*通信作者： 吳德玲 （1973—） ， 男， 教授， 碩士生導(dǎo)師。 Tel： （0551 ） 5169227， E-mail： dlwu7375@sina.com