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    沙門菌分型技術(shù)研究進(jìn)展

    2014-01-26 06:48:40,,,,,
    中國(guó)動(dòng)物檢疫 2014年6期
    關(guān)鍵詞:沙門噬菌體血清型

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    (揚(yáng)州大學(xué),江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇揚(yáng)州 225009)

    沙門菌分型技術(shù)研究進(jìn)展

    李昱辰,程瞾,蔡銀強(qiáng),焦揚(yáng),潘志明,焦新安

    (揚(yáng)州大學(xué),江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇揚(yáng)州 225009)

    沙門菌在自然界廣泛分布,是人和動(dòng)物常見的病原菌,可引起人和動(dòng)物傷寒、副傷寒、胃腸炎、敗血癥和局部感染等多種疾病。沙門菌分型方法分為以表型特征為依據(jù)的表型分型和以基因或基因組結(jié)構(gòu)特征為依據(jù)的分子分型。本文不僅回顧了傳統(tǒng)的分型方法,還重點(diǎn)介紹了最近發(fā)展迅速的多種分子分型方法,可為沙門菌的分型研究提供參考。

    沙門菌;表型分型;分子分型

    沙門菌在全球廣泛分布,寄生于人和動(dòng)物體內(nèi),也常見于污染的蛋、奶、肉類等食品,對(duì)公共衛(wèi)生安全危害極大。全球每年估計(jì)發(fā)生將近13億因沙門菌導(dǎo)致的急性胃腸炎病例,其中300萬(wàn)患者死亡。沙門菌感染也一直位居我國(guó)細(xì)菌性食物中毒的首位,約占感染總數(shù)的64%[1]。因此,采用有效的分型方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類,對(duì)人和動(dòng)物沙門菌病感染源的確定以及控制并減少發(fā)病率具有十分重要的意義。

    傳統(tǒng)的細(xì)菌分型方法大多是基于細(xì)菌的一些表型特征,這些常規(guī)方法在傳染病暴發(fā)時(shí)期的分型工作中發(fā)揮了重要作用,如血清學(xué)分型操作簡(jiǎn)便快速、重復(fù)性好、有商品化試劑,實(shí)際應(yīng)用中有著重要價(jià)值,一直被作為沙門菌常規(guī)檢測(cè)的一部分。但表型分型存在諸多局限性,不能滿足傳染病跨地區(qū)傳播流行病學(xué)調(diào)查、追蹤、溯源的需要。分子分型方法以其特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、敏感性高和分辨率佳的優(yōu)點(diǎn),逐步取代傳統(tǒng)表型分型技術(shù),在沙門菌診斷與分型中發(fā)揮巨大作用。本文就近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)沙門菌具有代表性的分型方法作綜述,對(duì)其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行闡述,旨在為沙門菌的快速、有效分型提供參考。

    1 沙門菌表型分型技術(shù)

    1.1 沙門菌血清學(xué)分型

    血清學(xué)分型作為沙門菌最常用的表型分型方法,已鑒定出2500多個(gè)不同的沙門菌血清型。由于具有較高的遺傳相似性,因此WHO國(guó)際沙門菌協(xié)作和研究中心將沙門菌屬分為腸道沙門菌和邦戈?duì)柹抽T菌2個(gè)種,并將腸道沙門菌分為亞種Ⅰ、Ⅱ、Ⅲa、Ⅲb、Ⅳ和Ⅵ6個(gè)亞種[1]。此方法直觀可靠,但仍存在一些缺陷,例如實(shí)驗(yàn)較為煩瑣、主觀性較強(qiáng)、鑒定時(shí)間長(zhǎng)等。另外,免疫鑒定主要是依靠血清與沙門菌抗原決定簇的特異性反應(yīng),但沙門菌多達(dá)2500多種血清型,如果反應(yīng)特異性不強(qiáng),如同時(shí)識(shí)別多個(gè)抗原或識(shí)別相應(yīng)的抗原失敗,就會(huì)造成血清型分型結(jié)果的錯(cuò)誤[2]。因此,越來(lái)越多的研究人員嘗試應(yīng)用新型技術(shù)進(jìn)行沙門菌的血清分型,從而使鑒定方法更加快捷而有效。例如劉斌等發(fā)掘了沙門菌血清組A-D和傷寒沙門菌、乙型副傷寒沙門菌等8種常見血清型沙門菌的特異PCR檢測(cè)靶點(diǎn),并以此分別建立了血清組和血清型多重PCR檢測(cè)體系[3]。

    1.2 噬菌體分型方法

    根據(jù)噬菌體對(duì)宿主菌的高度特異性,即一種噬菌體只能裂解一種與它相應(yīng)的細(xì)菌,因此常用該方法對(duì)未知細(xì)菌進(jìn)行鑒定和分型,但噬菌體感染和裂解細(xì)菌的能力與噬菌體分子特征及位于細(xì)菌表面的受體有關(guān)。

    噬菌體分型方法通常用于分析近源沙門菌(如同一血清型)。噬菌體分型在沙門菌大流行克隆的研究中顯示出明顯的作用,Boxrud等使用一個(gè)由10種噬菌體組成的分型系統(tǒng)對(duì)美國(guó)人源、動(dòng)物和食物等來(lái)源的573株腸炎沙門菌進(jìn)行分型,最常見的噬菌體型為8(48.2%),13a(20.1%),13(7.8%)和14b(7.8%)。大部分菌株噬菌體型都與美國(guó)北部蛋來(lái)源的沙門菌病暴發(fā)相關(guān),這說(shuō)明污染蛋類中的沙門菌可能是上述樣品中沙門菌大量分布的來(lái)源[4]。但噬菌體分型存在著不足,如操作煩瑣、人為因素影響大、重復(fù)性較差、難以標(biāo)準(zhǔn)化和噬菌體種類的限制導(dǎo)致部分細(xì)菌無(wú)法分型等問題。因此,只有在噬菌體儲(chǔ)備維護(hù)良好并且有特別訓(xùn)練過的實(shí)驗(yàn)人員的實(shí)驗(yàn)室開展噬菌體分型,其結(jié)果的準(zhǔn)確性才能有所保證[5]。

    2 沙門菌分子分型技術(shù)

    2.1 多位點(diǎn)序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)

    MLST技術(shù)于1998年由Maiden首先提出,主要基于管家基因或毒力相關(guān)基因的等位多態(tài)性進(jìn)行分型。通過PCR擴(kuò)增細(xì)菌病原微生物個(gè)體7個(gè)或更多管家基因內(nèi)部約450bp產(chǎn)物,通過測(cè)序,獲得核苷酸序列特征,根據(jù)序列不同分別對(duì)不同管家基因的等位基因分配基因序號(hào),管家基因的序列組合決定菌株特異性的序列型別(sequence typing,ST)。MLST選用的管家基因的數(shù)量一般是7個(gè)或者更多,但也有文獻(xiàn)報(bào)道基于3-4個(gè)管家基因的MLST分型試驗(yàn),如Mamuka等選擇了基于16SRNA,pduF,glnA和manB 4個(gè)基因的MLST方法對(duì)臨床和環(huán)境中的沙門菌進(jìn)行分型,發(fā)現(xiàn)其分型能力要強(qiáng)于脈沖場(chǎng)凝膠電泳(Pulsed feld gel electrophoresis,PFGE)[6]。研究還發(fā)現(xiàn)MLST結(jié)果與其他分型方法結(jié)果存在較高的一致性,如Sukhnanand等設(shè)計(jì)的基于manB,fmA 及mdh基因的MLST方法,對(duì)臨床相同的血清型有一定的區(qū)分力的同時(shí),對(duì)沙門菌血清型也能實(shí)現(xiàn)較為精確的預(yù)測(cè)[7]。

    MLST在沙門菌溯源中具有重要的作用,其獲得了管家基因內(nèi)部DNA的確切變異,使不同實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果比對(duì)變得十分便捷。對(duì)于許多細(xì)菌種屬包括沙門菌,已有多個(gè)聯(lián)網(wǎng)MLST數(shù)據(jù)庫(kù),尤其是網(wǎng)絡(luò)化MLST數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mlst. net/)使得細(xì)菌病原菌全球化的MLST分子流行病分析更為快速、可行。但是MLST主要是通過管家基因變異進(jìn)行分型,由于管家基因高度保守(突變積累很慢),所以其在區(qū)分高度關(guān)聯(lián)的菌株時(shí)還存在一定的缺陷,不僅對(duì)血清型相同的菌株區(qū)分能力較弱,甚至對(duì)不同血清型但遺傳關(guān)系較近的菌株也難以很好地區(qū)分[8]。近年來(lái),MLST技術(shù)發(fā)展了基于毒力基因和其他結(jié)構(gòu)基因的沙門菌分型技術(shù)。如Liu等基于毒力基因sseL、fmH 和規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)位點(diǎn)對(duì)171株沙門菌進(jìn)行分型,通過增加CRISPR序列長(zhǎng)度,這種新的MLST分型方法區(qū)分能力優(yōu)于PFGE分型,具有高度的流行病學(xué)一致性,能夠用于調(diào)查區(qū)分暴發(fā)的菌株[9]。

    2.2 可變串聯(lián)重復(fù)序列分析(multiple locus VNTR(Variable-Numbers tandem repeat) analysis,MLVA)

    隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,人們已完成了大量細(xì)菌的全基因組測(cè)序,發(fā)現(xiàn)大量細(xì)菌基因組中含有短小重復(fù)DNA序列組成的多重區(qū)域,這些重復(fù)序列長(zhǎng)度從幾個(gè)堿基到超過100 bp不等。這些差異隨菌株的不同而不同,而這些多態(tài)性的片段常稱為VNTR?;赩NTR的重復(fù)單元拷貝數(shù)的差異性來(lái)進(jìn)行分子分型的技術(shù)就稱為多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)。MLVA技術(shù)操作簡(jiǎn)單、容易掌握、重復(fù)性好、快速高效,易于在不同實(shí)驗(yàn)室推廣,PulseNet已將MLVA列為第二代分子分型方法,并應(yīng)用于多種細(xì)菌包括沙門菌的分子分型研究。與MLVA相比,PFGE信息的獲取需要標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和操作步驟,因此在一些情況下MLVA比PFGE更為敏感。Tien等對(duì)55株分離自南亞和東南亞的2000—2010年的甲副菌株進(jìn)行XbaI 和BlnI兩種限制性內(nèi)切酶的PFGE分型,并應(yīng)用基于6個(gè)位點(diǎn)的MLVA分型,共分成14種PFGE型別,23種MLVA型別,MLVA分辨指數(shù)0.937明顯大于PFGE分辨指數(shù)0.741[10]。

    MLVA在理論和技術(shù)方面都還處在發(fā)展和完善階段,如不同血清型MLVA引物的分辨率不同,篩選合適的MLVA位點(diǎn)還不能依賴其他血清型公布的基因組序列。因此盡管已有傷寒沙門菌、甲型副傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌等血清型的MLVA的標(biāo)準(zhǔn)方法公布,但這遠(yuǎn)不能滿足沙門菌近2500多個(gè)血清型的分型需求。

    2.3 脈沖場(chǎng)凝膠電泳(Pulsed feld gel electrophoresis,PFGE)

    PFGE是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來(lái)的常用于大分子量線性DNA的分離一種電泳技術(shù),其方法主要是將細(xì)菌包埋于瓊脂塊后,選取合適的內(nèi)切酶對(duì)其染色體進(jìn)行酶切,分子量不同的酶切片段能在方向、時(shí)間與電流大小交替改變的脈沖電場(chǎng)中得到良好的分離。

    PFGE具有重復(fù)性好、特異性高、分辨力強(qiáng)、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)勢(shì),可用于分析菌株之間的相關(guān)性,在溯源及疫情控制中發(fā)揮著重要的作用,被譽(yù)為細(xì)菌分子分型研究的“金標(biāo)準(zhǔn)”。1996年由美國(guó)CDC 首先發(fā)起、建立的實(shí)驗(yàn)室分子分型監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)PulseNet,就是通過分析分離株的DNA的指紋圖譜(PFGE技術(shù))以及網(wǎng)絡(luò)信息共享發(fā)展起來(lái)的,現(xiàn)已實(shí)現(xiàn)對(duì)北美、歐洲、亞太、中東等地區(qū)的全球化實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)覆蓋。其在大腸桿菌O157:H7、沙門菌和李斯特菌等常見致病菌的監(jiān)測(cè)、預(yù)報(bào)及暴發(fā)后來(lái)源的確定中發(fā)揮著重要作用。例如美國(guó)CDC通過PulseNet食源性監(jiān)測(cè)網(wǎng)對(duì)地理上分散,年齡和性別分布具有典型性的同一PFGE帶型蒙得維的亞血清型沙門菌感染進(jìn)行調(diào)查,通過病例對(duì)照研究,證實(shí)病例感染與食用污染的臘腸有關(guān)[11]。Marcus等對(duì)2005-2011香港239株醫(yī)院來(lái)源及546株中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病研究所保存的人源鼠傷寒沙門菌分離株進(jìn)行分子分型研究,發(fā)現(xiàn)CN006型的ST34鼠傷寒沙門菌及其相關(guān)的克隆與ACSSuTCip-oqxAB-aac(6’)Ib-cr 型鼠傷寒沙門菌在中國(guó)臨床上的大量出現(xiàn)有著重要的關(guān)系[12]。

    由于所需設(shè)備儀器昂貴、操作復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng),需要專業(yè)的操作人員等原因,這在一定程度上限制了PFGE技術(shù)在一般實(shí)驗(yàn)室中的推廣應(yīng)用。

    3 不同分型方法的聯(lián)合應(yīng)用

    不同的分型方法都有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn),這會(huì)影響到它們?cè)诖_定沙門菌分離株來(lái)源和親緣關(guān)系時(shí)的準(zhǔn)確性。為有效地確定沙門菌的克隆性和遺傳相關(guān)性,通常結(jié)合使用多種分型方法,研究表明這在鑒別近源株時(shí)非常有價(jià)值。如Dudley等發(fā)現(xiàn)將PFGE與CRISPR-MVLST相結(jié)合,能大大提高人源的腸炎沙門菌的區(qū)分能力[13]。而Atsushi等發(fā)現(xiàn)MLVA與PFGE聯(lián)合使用能提高牛源的鼠傷寒沙門菌和4,5,12:i:-沙門菌的分子分型能力,并且能在這些血清型的同一克隆中較為清楚地確定不同的克隆亞型[14]。日常監(jiān)測(cè)中,可先應(yīng)用血清分型來(lái)分類沙門菌分離株,之后應(yīng)用如抗生素敏感實(shí)驗(yàn)和噬菌體分型等表型分型方法來(lái)進(jìn)一步確定病原體。再使用PFGE,MLVA,MLST等分子分型技術(shù)進(jìn)一步鑒別引起食源性疾病沙門菌菌株的親緣相關(guān)性。因此選擇合適的分型方法以及合理安排所選方法的順序能夠幫助實(shí)現(xiàn)沙門菌分型能力的最大化。

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    Progress in research on Salmonella typing methods

    Li Yuchen,Cheng Zhao,Cai Yinqiang,Jiao Yang,Pan Zhiming,Jiao Xinan
    (Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis/Jiangsu Co-Innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses,Yangzhou University,Yangzhou 225009)

    Salmonella is distributed widely in nature,one of the common pathogenic bacterium both in people and animals. It can cause typhoid fever,paratyphoid fever,enteritis,septicemia and localized infection in humans and animals. There are many methods in Salmonella typing,which could be divided into phenotype typing based on phenotypic characterization and genotyping based on the structure character of genes or genomes. Beside the traditional Salmonella typing methods,the paper reviewed and introduced the recently-developed molecular typing methods,which can provides reference for Salmonella typing.

    Salmonella;phenotype typing;genotypin

    R378.2

    :A

    :1005-944X(2014)06-0032-04

    公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201403054)、863課題(2012AA101601-6)、江蘇省“六大人才高峰”(2012-NY-028)、江蘇省高校青藍(lán)工程中青年學(xué)術(shù)帶頭人培養(yǎng)對(duì)象、江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程

    潘志明

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