柔嫩艾美耳球蟲體外培養(yǎng)方法與影響因素

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（1.太谷縣動物疫病預(yù)防與控制中心，山西太谷030800；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801）

柔嫩艾美耳球蟲體外培養(yǎng)方法與影響因素

田永清1，張妍2，鄭明學(xué)2，王麗霞2

（1.太谷縣動物疫病預(yù)防與控制中心，山西太谷030800；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801）

雞球蟲的體外培養(yǎng)方法有雞胚培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)兩種，即球蟲在雞胚和體外培養(yǎng)細(xì)胞中完成從子孢子到卵囊的內(nèi)生性發(fā)育過程。體外培養(yǎng)對深入研究球蟲學(xué)及球蟲病學(xué)具有重要的作用和意義。本文從細(xì)胞和雞胚兩個方面對球蟲體外培養(yǎng)進行分析和討論，以便為球蟲病的研究提供技術(shù)支持。

雞球蟲；雞胚培養(yǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)；體外培養(yǎng)

雞球蟲病主要危害3月齡內(nèi)的雛雞，以15～50日齡的雛雞發(fā)病率最高，死亡率可達80%以上，雞球蟲病對養(yǎng)雞業(yè)危害十分嚴(yán)重[1-2]。寄生蟲的體外培養(yǎng)可為寄生蟲和寄生蟲病學(xué)研究提供一個高效、直觀的模型，是寄生蟲生物學(xué)特性、診斷試劑、藥物、疫苗、寄生蟲與宿主相互作用研究的一個極具價值的技術(shù)平臺[3]。雞球蟲的體外培養(yǎng)方法有雞胚培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)兩種，即球蟲在雞胚和體外培養(yǎng)的細(xì)胞中完成從子孢子到卵囊的內(nèi)生性發(fā)育過程[1]。

Long[4]曾報道有數(shù)種雞球蟲能在雞胚的絨毛尿囊膜上發(fā)育，但只有E. tenella 子孢子接種雞胚后能獲得卵囊。1972年，Long[4]首次用雞胚傳代的方法培育出E.tenella致弱蟲株，建立了球蟲雞胚培養(yǎng)技術(shù)。李艷琴等報道[5]，張勤和楊振中等分別采用Long的雞胚傳代方法建立了雞胚傳代株。細(xì)胞培養(yǎng)幾乎與雞胚培養(yǎng)同步發(fā)展，Patton等[6]首次報道了E. tenella在細(xì)胞培養(yǎng)中的發(fā)育。1970年，Doran[7]首次報道了E.tenella在雞原代腎細(xì)胞中發(fā)育到卵囊。

球蟲的體外培養(yǎng)包括：①制備待培養(yǎng)物，如子孢子和裂殖子的制備等；②創(chuàng)造和優(yōu)化人工環(huán)境，即進行細(xì)胞培養(yǎng)和雞胚培養(yǎng)，并用生化方法和物理方法調(diào)整人工環(huán)境，使之盡可能接近自然宿主所提供的環(huán)境；③將待培養(yǎng)物接種于優(yōu)化的人工環(huán)境中[8]。下面從上述3方面對球蟲體外培養(yǎng)作簡要分析。

1 子孢子的分離純化[8]

分離出無菌、無雜質(zhì)的子孢子是體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)，要獲得純化的子孢子，必須先收集純化卵囊。目前主要的收集卵囊的方法是漂浮法、蛋白酶消化法、糖溶液梯度消化法、離心淘析法、激光顯微鏡分離法、單卵囊分離法等，其中飽和鹽水漂浮法最常用。用于體外培養(yǎng)的卵囊從腸道中純化比從糞便中獲得的效果更好。對孢子化卵囊的除菌常用次氯酸鈉，對子孢子無毒害。子孢子的脫囊分機械消化法和直接消化法。直接消化法是在卵囊壁完整無損的條件下，直接利用CO2和消化液的作用，消化卵囊和子孢子壁，釋出子孢子；機械消化法是先借助機械力破壞卵囊壁，釋出孢子囊，再用消化液消化孢子囊，釋出子孢子，這種方法也是目前釋放卵囊的最好方法。謝明權(quán)等[9]通過試驗研究發(fā)現(xiàn)，用0.125%胰蛋白酶和0.175%膽酸鹽（TDC）脫囊45 min，脫囊率可達95%；用0.125%胰蛋白酶和5%～10%雞膽汁，脫囊75 min，脫囊率達到91%和95%。對于子孢子的提純，宋翠平等[10]研究表明，DEAE-纖維素柱雖經(jīng)酸堿處理和無菌溶液洗脫，但其裝置的缺陷性使其無法保證嚴(yán)格無菌，易造成細(xì)胞培養(yǎng)中的污染。而玻璃珠柱則能高壓滅菌，且可移入超凈工作臺中無菌操作，獲得的子孢子基本無菌。G漏斗過濾的子孢子仍有少量雜質(zhì)，但易無菌操作，適宜于對子孢子純度要求不高的雞胚培養(yǎng)[1]。

2 雞胚培養(yǎng)

1965年，Long[4]首次報道了堆型艾美耳球蟲在雞胚中可以完成整個發(fā)育史。隨后Shibalova和Long陸續(xù)報道了毒害艾美耳球蟲、布氏艾美耳球蟲、和緩艾美耳球蟲、早熟艾美耳球蟲、脆弱艾美耳球蟲可在雞胚發(fā)育。謝明權(quán)等[11]用雞胚連續(xù)繁殖柔嫩艾美耳球蟲24代，建立了柔嫩艾美耳球蟲雞胚適應(yīng)株。雞胚繁殖球蟲的成功，不僅為研究球蟲疫苗和防治藥物提供了新的技術(shù)平臺，而且為開展球蟲分子生物學(xué)研究提供了保證。影響球蟲在雞胚發(fā)育的因素主要有[8]：

2.1 蟲源性因素

蟲種不同在雞胚中生長發(fā)育和致病性存在很大差異，同一種球蟲的潛隱期存在種內(nèi)差異。柔嫩艾美耳球蟲的蟲株經(jīng)連續(xù)傳代變成的胚胎適應(yīng)株，與未曾傳代的父代株相比，產(chǎn)生的卵囊量多，但致病力弱。用不同劑量的球蟲子孢子接種雞胚，隨接種劑量的增大，雞胚的死亡率可達100%。此外，卵囊保存時間的長短也影響雞胚的死亡率及平均病變數(shù)。

2.2 胚源性因素

不同品系的仔雞和雞胚在接種球蟲后的易感性存在差異。

2.3 環(huán)境性因素

柔嫩艾美耳球蟲在41℃下的發(fā)育比在稍低的溫度下發(fā)育要快。研究還發(fā)現(xiàn)胚胎中柔嫩艾美耳球蟲在低于41℃條件下孵育，卵囊的生產(chǎn)減少和延遲。在接種前對雞胚進行藥物處理后，產(chǎn)生的配子體數(shù)目有所改變。

3 細(xì)胞培養(yǎng)

3.1 蟲源性

和雞胚培養(yǎng)一樣，接種球蟲子孢子的保存時間、接種劑量以及對子孢子接種前的處理等都對其在細(xì)胞中存活、發(fā)育有很大影響。

3.2 細(xì)胞源性

艾美耳球蟲在有些細(xì)胞中存活和發(fā)育比在其它一些細(xì)胞中要好。對接種子孢子后尚不能在細(xì)胞培養(yǎng)中完成生活史的艾美耳球蟲來說，最適宜其盡可能向前發(fā)育的細(xì)胞一般是天然宿主細(xì)胞。國內(nèi)外培養(yǎng)雞球蟲常用的細(xì)胞類型為雞腎原代細(xì)胞和雞胚腎細(xì)胞，對柔嫩艾美耳球蟲而言，最適宜的細(xì)胞是雞盲腸上皮細(xì)胞。此外，培養(yǎng)細(xì)胞的密度及在原代培養(yǎng)建立之前，組織被胰蛋白酶消化的程度對柔嫩艾美耳球蟲的發(fā)育也有一定影響。

3.3 溫度

不同溫度對子孢子發(fā)育到卵囊有直接影響，柔嫩艾美耳球蟲在41℃下可發(fā)育至成熟裂殖體，在37℃下則不能，雞的正常體溫為41℃左右，體外細(xì)胞培養(yǎng)的溫度應(yīng)嚴(yán)格模擬宿主體內(nèi)溫度[12]。

3.4 培養(yǎng)基

Doran[6]比較了5種培養(yǎng)液對接種在雞胚腎細(xì)胞中的E.tenella子孢子的發(fā)育所起的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)80%的Hank's平衡鹽溶液加10%的水解乳蛋白、10%的胎牛血清可作為細(xì)胞生長培養(yǎng)液。接種子孢子后將胎牛血清和水解乳白蛋各減至5%，作為細(xì)胞維持液；或接種后，培養(yǎng)液換為90%的Eagle's基礎(chǔ)培養(yǎng)液或HBSS 199培養(yǎng)液并均加5%水解乳蛋白和5%胎牛血清作為細(xì)胞維持液。后者卵囊產(chǎn)量比前者要多26%～57%。接種后加水解乳蛋白時，孵囊產(chǎn)量超過接種前后都加水解乳蛋白的培養(yǎng)系統(tǒng)的產(chǎn)量。謝明權(quán)等[9]發(fā)現(xiàn)α-MEM營養(yǎng)液作為E. tenella在體外細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，卵囊產(chǎn)量最高。張健騑等[12]則認(rèn)為相比Dalbecco改良的Eagle's 營養(yǎng)液，Eagle's基礎(chǔ)營養(yǎng)液、Hank's鹽平衡液、RPMI1640營養(yǎng)液的效果更好。謝宏料等[14]認(rèn)為α-MEM培養(yǎng)基比1640培養(yǎng)基有顯著增加第二代裂殖體和卵囊數(shù)量的效果，原因是α-MEM培養(yǎng)基中含有核糖核苷和脫氧核糖核苷，為球蟲體外培養(yǎng)時的蛋白質(zhì)代謝和核酸代謝提供了所需的基礎(chǔ)物質(zhì)，從而有利于蟲體的發(fā)育。古少鵬等[15]對DMEM培養(yǎng)基和MEM 199培養(yǎng)基的成分進行比較發(fā)現(xiàn)，MEM 199培養(yǎng)基除了含有必須的氨基酸、碳水化合物和無機鹽外，還含有其他物質(zhì)，如脫氧核糖、核糖、硫酸腺嘌呤、ATP、腺苷一磷酸、膽固醇、鳥嘌呤等，而DMEM中沒有。在子孢子入侵和發(fā)育過程中，ATP可為其提供能量，脫氧核糖和核糖可為其合成DNA提供組分，腺苷一磷酸可為其合成RNA提供組分，硫酸腺嘌呤、鳥嘌呤可為其核酸代謝提供組分，所以試驗中用MEM 199培養(yǎng)基作為子孢子接種培養(yǎng)基更有利于蟲體發(fā)育[8]。

血清含有細(xì)胞生長所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)，其中的激素與生長調(diào)節(jié)因子，具有促進細(xì)胞生長的作用；血清中還含有促進細(xì)胞黏附和鋪展的因子，如纖維連接蛋白，對于貼壁依賴型細(xì)胞的粘附和鋪展必不可少。謝明權(quán)等[9]發(fā)現(xiàn)α-MEM 營養(yǎng)液中添加0. 05ng/ mL的胰島素，卵囊產(chǎn)量大大提高；張健騑等[13]認(rèn)為牛血清比雞血清效果好，尤其接種后1～4天用10%牛血清，5～7天改用5%雞血清，其卵囊產(chǎn)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于只用雞血清。若1～7天全用牛血清，產(chǎn)卵量比只用雞血清及牛血清雞血清混用的產(chǎn)量高[9]。古少鵬等認(rèn)為腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清（FBS），F(xiàn)BS對腸上皮細(xì)胞生長有明顯的促進作用，且呈劑量－效應(yīng)關(guān)系[15]。但隨著FBS量的增加，非腸上皮細(xì)胞數(shù)量也增多。同時發(fā)現(xiàn)在96h前用2.5%的FBS，96h后降為1%，在發(fā)育后期有較高的蟲體感染率[16]。

Upton等[17]研究了在體外細(xì)胞培養(yǎng)中外源性物質(zhì)對子孢子的活動性和發(fā)育過程所起的作用，發(fā)現(xiàn)白蛋白和胎球蛋白作培養(yǎng)液的補充物能夠促進子孢子的運動和進入培養(yǎng)細(xì)胞。張健騑等[13]在體外培養(yǎng)條件下，測定了單項維生素（濃度為RPMI-1640標(biāo)準(zhǔn)量的5倍）對球蟲卵囊的影響，結(jié)果顯示球蟲在只有氨基酸、葡萄糖的培養(yǎng)基中雖然也能發(fā)育，但其卵囊數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于營養(yǎng)成分完全的培養(yǎng)基。球蟲的核酸代謝主要有嘌呤代謝和葉酸代謝，可通過培養(yǎng)基中添加葉酸的方式促進柔嫩艾美耳球蟲子孢子在體外發(fā)育過程中的核酸代謝[13]。除葉酸外，VB6對卵囊的形成也有較高的影響，VB1也略能提高卵囊數(shù)。謝宏料，謝明權(quán)等[14]對葉酸、VB6、VB1的最適用量進行了探討，發(fā)現(xiàn)當(dāng)葉酸、VB6、VB1的含量為6 mg/L時，更有利于柔嫩艾美耳球蟲子孢子在宿主細(xì)胞中的體外發(fā)育。

古少鵬等[16]認(rèn)為胰島素具有促進雞原代腎細(xì)胞的生長和柔嫩艾美耳球蟲第二代成熟裂殖體形成及提高卵囊數(shù)量的作用，他們在MEM 199培養(yǎng)基中葡萄糖添加量為3000 mg/L的情況下，添加了0.40 mg/L的胰島素，目的是促進柔嫩艾美耳球蟲子孢子在發(fā)育過程中能更好的發(fā)育。

3.5 pH值

古少鵬等[16]通過試驗發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的pH值為7.4時最適宜卵囊的產(chǎn)生，而球蟲對酸性培養(yǎng)基（低pH值）的耐受性比堿性培養(yǎng)基強。培養(yǎng)基的pH值在6.0～8.0的范圍內(nèi)，球蟲能正常發(fā)育，產(chǎn)生卵囊，但卵囊產(chǎn)量卻有高低之分，說明培養(yǎng)基的pH值是影響卵囊產(chǎn)量的主要因素之一[8]。

3.6 CO2和不同氧濃度對球蟲體外培養(yǎng)的影響

Fukata等[18]研究了子孢子接種到體外培養(yǎng)細(xì)胞中在不同氧濃度下的發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)在5%CO2/95%空氣條件下，相比有氧和厭氧條件下，子孢子進入細(xì)胞的數(shù)量多3～4倍。古少鵬等[15]研究發(fā)現(xiàn)，子孢子在8%～10%CO2條件下進入盲腸上皮細(xì)胞數(shù)多于5% CO2條件。

隨著研究的深入，球蟲的體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已成為必備的技術(shù)之一，新的細(xì)胞系和檢測技術(shù)的不斷出現(xiàn)，將會使球蟲的細(xì)胞培養(yǎng)體系更加完善和方便。國內(nèi)外學(xué)者已進行了大量的研究，并在原代雞腎細(xì)胞和雞胚腎細(xì)胞中取得成功。但此類細(xì)胞非雞球蟲的真正宿主細(xì)胞，故所建立的細(xì)胞模型也無法準(zhǔn)確反映球蟲與宿主細(xì)胞的作用機制[16]。目前球蟲的細(xì)胞培養(yǎng)還面臨許多挑戰(zhàn)，如目前球蟲的傳代細(xì)胞培養(yǎng)體系中的蟲體不能完成整個生活史，這為研究球蟲各個階段的蛋白功能帶來很大的阻礙。

[1] 陳珊.雞柔嫩艾美耳球蟲體外模型的建立及其HSP70基因的克隆表達下載[D]. 西安：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2008.

[2]Allen P C， Petter R H. Rencent advances in biology and immunobiology of Eimeria species and in diagnosis and control of infection with these coccidian parsites of poultry[J].Clin Micorbiol Rev，2002，15（1）：59-65.

[3] 朱俊勇.血吸蟲幼蟲期的體外培養(yǎng)與生長發(fā)育[J].中國地方病學(xué)雜志，2006，25（5）：581-582.

[4] Long P L. Development of Eimeria tenella in avaiembryos[J]. Nature，1965，208（5009）：509-510.

[5] 李艷琴， 王振海， 秦建華，等. 雞球蟲病免疫防治研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2008， 36（ 13） ： 5438- 5440 .

[6] Patton W H. Eimerla tenella： Cultivation of the a sexual stage in culture animal cells [J] Scicence， 1965， 150： 660-663.

[7] Doran D J.Eimeria tenella：from sporozoites to oocysts in cell culture[J].Proc Helm Soc Wash.1970，37：84-92．

[8] 王麗霞，鄭明學(xué).雞球蟲體外培養(yǎng)研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2006，33（11）：81-83.

[9] 謝明權(quán)，張健騑，吳惠賢，等.球蟲體外模型的建立及在生物學(xué)和生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2000，25（1）：3-5.

[10] 宋翠平，沈永林.雞球蟲體外細(xì)胞培養(yǎng)的研究進展[J].中國動物檢疫，1998，15（2）：46-48.

[11] 謝明權(quán)，吳刊賢.球蟲體外模型的建立及在生物學(xué)和生產(chǎn)中的應(yīng)用[J]. 廣東畜牧獸醫(yī)科技，2000，25（1）：3-6.

[12] 索勛，李國清.雞球蟲病學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1998.

[13] 張健騑，謝明權(quán)，彭新宇，等.球蟲細(xì)胞培養(yǎng)影響因素探討[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999，5：46-47.

[14] 謝宏料，謝明權(quán)，吳惠賢，等.不同培養(yǎng)基成分在球蟲細(xì)胞培養(yǎng)中的作用[J].動物學(xué)報， 1996，42（3）：316-323.

[15] 古少鵬，王敏霞，趙素芬.雞胚盲腸上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)與鑒定[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2009，40（11）：1699-1704.

[16] 古少鵬，侯金環(huán)，陳趙英，等.柔嫩艾美耳球蟲在雞盲腸上皮細(xì)胞中體外培養(yǎng)營養(yǎng)條件的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2010，41（12）：1622-1628.

[17] Upton S， Tilley M. Effect of select medium supplements on motility and development of Eimeria nieschulzi in vitro[J]. Journal of Parasitology，1992，78（2）：329-333.

[18] Fukata T， Sasai K， Arakawa A， et al. Penetration of Eimeria tenella sporozoites under different oxygen concentrations in vitro[J]. The Journal of Parasitology， 1992，78：537-538.

Culture method and infuencing factors of Eimeria tenella in vitro

Tian Yongqing1，Zhang Yan2， Zheng Mingxue2，Wang Lixia2
（1. Center of Animal Diseases Prevention and Control，Taigu 030800， Shanxi；2. College of Animal Science and Technology，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，Shanxi）

There are two approaches in vitro for chicken coccidian： chick embryo culture and cell culture for completing the endogenous development from sporozoites to oocysts，In vitro culturing has an important role and signifcance in the further studies of coccidia and coccidiosis. Both chick embryo culture and cell culture for in vitro coccidian culturing were analyzed and discussed in this paper in a attempt to provide technical supports for coccidiosis research.

chicken coccidia；chick embryo culture；cell culture；in vitro

S858.31

：A

：1005-944X（2014）05-0041-04

國家自然科學(xué)基金項目（31272536）

鄭明學(xué)