馬泰勒蟲二溫式PCR檢測方法的建立及應用

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（1.新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830052；2.伊犁出入境檢驗檢疫局，伊寧835000）

馬泰勒蟲二溫式PCR檢測方法的建立及應用

李佳1，李永暢1，王振寶2，張楊1，巴音查汗1

（1.新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830052；2.伊犁出入境檢驗檢疫局，伊寧835000）

為給馬泰勒蟲提供特異、快速、敏感的檢測方法，根據馬泰勒蟲18S rRNA保守基因序列，設計了一對特異性引物，建立馬泰勒蟲二溫式PCR檢測方法。擴增出的目的片段大小為139 bp，經克隆、測序分析，與GenBank上登錄的序列相似性為100%。該方法與其他蟲種無交叉反應，具有一定的靈敏性和特異性。應用所建立的方法對采集的30份疑似病例全血樣品進行檢測，陽性率為33.3%，相比之下相同樣品的血液涂片檢查的陽性率為13.3%。與三溫PCR方法比較減少了反應時間的消耗，提高了檢測效率，該方法對馬泰勒蟲病的早期（潛伏感染期）檢測、診斷具有實際應用價值。

馬泰勒蟲；18S rRNA；二溫式PCR；檢測

馬泰勒蟲（Theileriaequi）是由媒介蜱傳播的一種血液寄生蟲，主要感染馬屬動物紅細胞，潛伏期可達24天，在臨床上主要表現(xiàn)為高熱、黃疸、貧血、淋巴結腫大等癥狀[1]，如不及早診斷和及時治療極易導致死亡，嚴重影響馬產業(yè)的發(fā)展。該病具有一定的季節(jié)性和區(qū)域性。我國主要馬產區(qū)均有該病發(fā)生的報道[2]，我們實驗室遇到的病例亦很普遍。由于馬泰勒蟲病危害大，不容易根治，對國際貿易產生很大影響，因此世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將馬泰勒蟲病列為重要動物疾病，我國將其列為二類病[3]。近年來該病呈上升趨勢，我國從國外引進優(yōu)良馬匹也有所增加，為防止馬泰勒蟲病的傳入、傳出，馬泰勒蟲病檢驗檢疫工作尤為關鍵。本研究依據PCR技術原理[4-5]，建立了二溫式PCR檢測方法，該方法比傳統(tǒng)的血液涂片方法要快速、靈敏，與三溫PCR相比較，縮短了反應時間，提高了檢測效率。該方法的建立，為馬泰勒蟲病的流行病學調查及疫病監(jiān)控提供簡便、快捷、高效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 蟲株與檢測樣品

馬泰勒蟲、駑巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲、牛巴貝斯蟲均由本實驗室保存；臨床疑似病例樣品采自新疆伊犁昭蘇縣，共30份抗凝全血。

1.2 主要試劑及儀器

全血DNA提取試劑盒（DNA Mini Kit）購自QIAGEN公司；Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs、DL2000 Marker、pXT19-T載體、膠回收試 劑 盒（MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0）、質粒小量提取試劑盒（Mini BEST Plasmid Purifcation Kit Ver.3.0）等均購自寶生物工程（大連）有限公司；NANODROP 2000c、TProfessional PCR儀購自Thermo公司。

1.3 引物設計與合成

根據GenBank上登錄的馬泰勒蟲18S rRNA基因序列，利用Primer Premier 6.0和Oligo軟件設計一對引物（T.e-F：5’-TTGCGGTGTTTCGGTGA-3’；T.e-R：5’-TCTCCGGAATCGAACCC-3’），目的片段大小為139 bp，由北京鼎國生物技術有限公司合成。

1.4 馬泰勒蟲DNA的提取

將臨床癥狀為馬泰勒蟲病，且經血液涂片染色鏡檢為陽性的馬泰勒蟲病的抗凝血，按照全血基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA，用紫外分光光度儀測DNA的含量，置 20℃保存。

1.5 二溫式PCR反應體系及條件優(yōu)化

PCR反應在25μL體系中進行，對影響PCR反應的主要參數Mg2+濃度、dNTP濃度、引物濃度和退火溫度進行優(yōu)化。

1.6 陽性標準品制備

使用膠回收試劑盒將PCR產物回收和純化，將回收的PCR產物與pXT19-T 載體連接，轉化至感受態(tài)細胞E.coliDH5α，經藍白斑篩選，挑取白色單菌落接種于含氨芐青霉素LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，提取質粒進行PCR鑒定，將鑒定為陽性的質粒送北京鼎國生物技術有限公司測序鑒定。

1.7 特異性試驗

以馬泰勒蟲基因組DNA為試驗樣本，同環(huán)形泰勒蟲、牛巴貝斯蟲、駑巴貝斯蟲基因組DNA為對照樣本，按照最佳退火溫度進行PCR反應，檢驗其特異性。

1.8 敏感性試驗

對所提取的馬泰勒蟲DNA用紫外分光光度計測定DNA的濃度，對該模板進行10倍系列稀釋，使用最佳反應條件進行二溫式PCR擴增，確定反應體系的敏感性。

1.9 樣品檢測

使用建立的方法對采自新疆伊犁的30份疑似病例樣品進行檢測，并與血液涂片染色進行鏡檢進行比較。

2 結果

2.1 PCR反應體系及反應條件的優(yōu)化

通過對二溫式PCR反應體系及反應條件的優(yōu)化，最終確定的最佳反應體系為（25 μL）：10 ×PCR buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol）2 μL，dNTPs（2.5 mmol）2 μL，上下游引物（10 μmol）各1 μL，Taq DNA 聚合酶（5 u/μL）0.2 μL，模板DNA 1 μL，加滅菌ddH2O至25 μL。最佳反應條件：94℃預變性3 min；95℃ 15s，61℃ 45s，40個循環(huán)；61℃延伸5min。PCR產物進行12 g/L瓊脂糖凝膠電泳，擴增出條帶大小為139bp的電泳條帶，與預期設計的目的片段大小相符（圖1）。

圖1 PCR反應體系及循環(huán)條件的優(yōu)化

2.2 重組質粒的鑒定結果

將提取的質粒進行二溫式PCR擴增，得到一條與預期大小一致的特異性片段，將鑒定為陽性的重組質粒送北京鼎國生物技術有限公司測序，經DNA Star軟件分析比對，PCR產物序列與參照序列（GenBank錄號為EU462510）相似性達100%（圖2）。

圖2 PCR擴增產物測序結果

2.3 特異性試驗

使用優(yōu)化的二溫式PCR方法，分別通過對馬泰勒蟲、駑巴貝斯蟲、牛環(huán)形泰勒蟲、牛巴貝斯蟲核酸樣品進行擴增，結果顯示只有馬泰勒蟲在139 bp處有條帶出現(xiàn)（圖3），而其他樣品均無條帶出現(xiàn)，說明該方法對馬泰勒蟲具有特異性。

圖3特異性試驗結果

2.4 敏感性試驗

對所提取的馬泰勒蟲DNA，使用紫外分光光度儀測定DNA的含量，計算DNA的濃度（原始濃度為38 ng/μL），然后以10倍系列稀釋進行二溫式PCR進行擴增，凝膠電泳結果顯示在樣品稀釋107倍時還有可見的條帶（圖4），說明檢測最低含量為38 fg。

圖4敏感性試驗結果

2.5 臨床樣品檢測

通過對采自新疆伊犁新源縣30份全血分別使用所建立的二溫式PCR方法和血液涂片檢測。結果二溫式PCR的陽性檢出率為33.3%，血液涂片陽性檢出率為13.3%，且通過血液涂片檢測出的陽性，PCR檢測均為陽性；部分血液涂片檢測出的陰性，通過建立的PCR方法檢測為陽性。說明所建立的二溫式PCR 方法比傳統(tǒng)的血液涂片鏡檢方法更敏感，可用于馬泰勒蟲病的早期及隱性感染病例的檢測。

3 討論

本研究依據常規(guī)PCR基本原理，將退火和延伸溫度合二為一而建立了二溫式PCR。對比二溫式PCR 與常規(guī)PCR檢測方法，二者在檢測的敏感性方面無顯著差異，但二溫式PCR的退火和延伸過程是在同一溫度下進行，其最佳溫度為61℃，使引物與模板能準確結合而且穩(wěn)定性好，以減少非特異擴增[6-7]，在整個循環(huán)中只有兩個溫度變化，操作上較常規(guī)三溫式PCR更為簡單，還可縮短操作時間，使對病原的檢測更省時、快捷，此方法可以應用于流行病學調查和大量臨床樣品檢測。

該方法還可避免血清學（免疫學方法）方法檢測的假陽性。當馬匹感染蟲體后，機體產生抗體（經治療將體內蟲體殺死，其抗體水平可持續(xù)一段時間），通過血清學檢測會造成假陽性的檢測結果[8]。

該方法比傳統(tǒng)的血液涂片方法要快捷、檢出率高的特點。血液涂片染色鏡檢結果易受到很多因素的影響，如處于帶蟲狀態(tài)的隱性感染，并無明顯癥狀的馬匹或操作不當及使用較差等顯微鏡等情況下發(fā)現(xiàn)蟲體是很困難的[9]。

本實驗，對采自的疑似病例馬匹30份樣品進行了血液涂片染色鏡檢（陽性率為13.3%）的同時，使用所建立的二溫式PCR檢測方法進行了檢樣（陽性檢出率為33.3%），結果表明二溫PCR檢測方法比血涂片檢測方法更特異、更敏感，更適合于本病的早期診斷、隱性感染和流行病學調查研究。

[1] 羅金.馬泰勒蟲分類學定位佐證及PCR、ELISA檢測方法的建立[D].蘭州：甘肅農業(yè)大學，2011：1-8.

[2] Xuan X， Bayin C， Huang X， et al.Diagnosis of equine piroplasmosis in Xinjiang province of China by the enzymelinked immunosorbent assays using recombinant antigens[J]. Veterinary Parasitology， 2002，108（2）：179-182.

[3] 中華人民共和國出入境動植物檢疫條約集[G].北京：中華人民共和國國家出入境檢驗檢疫局，2000：4-4.

[4] 熊煥章，劉冰，張守發(fā).馬巴貝斯蟲PCR檢測方法的建立及應用[J].延邊大學農學學報， 2007， 29（2）：129-133.

[5] Rampersad J，Cesar E，Campbell M D，et al. A field evaluation of PCR for the routine detection of Babesiaequi in horses[J].Veterinary Parasitology， 2003，114（2）：81-87.

[6] 董倩，黃國強，葉冰瑩，等.二溫式PCR在特異短核酸探針合成中的應用[J].花生學報，2008， 37（3）：5-10.

[7] 王振寶，劉啟生，哈森，等.牛環(huán)形泰勒蟲病二溫式PCR診斷方法的建立及初步應用[J].動物醫(yī)學進展，2012，33（5）：59-63.

[8] 薛書江，于龍政，曹世諾，等.駑巴貝斯蟲PCR檢測方法的建立及應用[J].河南農業(yè)科學， 2007（4）：106-109.

[9] 鄭小龍，徐彪，王群，等.馬巴貝斯蟲液相芯片檢測方法的初步建立[J].分析測試學報， 2012， 31：161-164.

Establishment and application of a two-temperature PCR assay for detection of Theileria equi

Li Jia1，Li Yongchang1，Wang Zhenbao2，Zhang Yang1，Bayin Chahan1
（1.College of Animal Medicine，Xinjiang Agriculture University，Urumqi， Xinjiang 830052；2.Yili Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Yining，Xinjiang 835000）

To establish a specifc， rapid and sensitive detection method for Theileria equi（T.equi）， a pair of specific primers was designed according to the conservative 18S rRNA gene sequence of T.equi and a two-temperature PCR assay for T.equi was established. The amplifed target fragment，139 bp in size was cloned and sequenced. Compared with the GenBank registered sequence，the similarity was 100% by sequence analysis.The assay showed no cross-reaction with other protozoon parasites，suggesting high specifcity. 30 whole blood samples collected were tested by the developed assay，and the positive rate of T.equi was 33.3%.While the positive rate of blood smear test was 13.3%.Compared with the three-temperature PCR assay， the reaction time was reduced and the detection effciency improved.The twotemperature PCR assay could be used for early detection and diagnosis of latent infection by T.equi with practical value.

T.equi；18S rRNA；two-temperature PCR；detec

S852.723； S858.21

：A

：1005-944X（2014）05-0078-03

國家科技支撐計劃課題（2012BAD46B01-04）

巴音查汗（E-mail）bynch@hotmail.com