我國O型Mya-98口蹄疫病毒流行情況與毒株分析

何繼軍，楊亞民，馬維民，尚佑軍，呂 律，鄭海學(xué)，靳 野，郭建宏，劉在新，劉湘濤

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046）

口蹄疫（Foot and Mouth Disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV）引起偶蹄動物急性、熱性、高度接觸傳染性的傳染病，以其發(fā)病急、傳播迅速、發(fā)病率高、宿主譜系廣、危害大而倍受世界各國重視，國際動物衛(wèi)生組織（Off i ce International des Epizooties，OIE）將其列為法定報告動物疫病。FMDV屬小RNA病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒屬（Aphthovirus），有 O、A、C、Asia1和 SAT1、SAT2、SAT3等7個血清型[1]。血清型間無交叉免疫現(xiàn)象，即使在同一血清型內(nèi)不同病毒的抗原性也有變化[2-3]，這為口蹄疫的防制帶來一系列復(fù)雜的問題。OIE/FAO世界口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室（OIE/FAO World Reference Laboratory for Foot and Mouth Disease，WRLFMD）對全球口蹄疫分子流行病學(xué)研究，將O型口蹄疫病毒株分為不同的拓?fù)湫停粗袊诺湫停–ATHAY）、中東－南亞型（Middle East-South Asia，ME-SA）、 東南亞型（South-East Asia，SEA）、印度尼西亞型（Indonesia，ISA）、東非型（East Africa，EA）、西非型（West Africa，WA）、 歐洲－南美型（Europe-South America，EURO-SA）[4-5]。根據(jù)國口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室流行病學(xué)研究資料，我國目前主要流行東南亞 型（SEA）、 中東-南亞型（ME-SA）等2個拓?fù)湫投局?。尤其以SEA拓?fù)湫拖翸ya-98毒株引起的疫情最為嚴(yán)重。

2010年年初，廣東省廣州市白云區(qū)一豬場發(fā)生由Mya-98毒株引起的口蹄疫疫情，隨之撲殺了大量的染疫動物和同群畜，經(jīng)濟(jì)損失巨大，我國及時向OIE報告了該起疫情。隨后，我國大面積暴發(fā)由該毒株引起的疫情，發(fā)病動物有豬、牛、羊等，疫情形勢十分嚴(yán)峻。與此同時，日本、韓國、朝鮮、蒙古、俄羅斯和中國香港、臺灣等國家和地區(qū)也報告發(fā)生由該毒株引起的疫情[6-9]。在此背景下，本研究系統(tǒng)地搜集和整理了我國2010年至2013年年底O型Mya-98毒株，明確了Mya-98毒株在我國的分布與流行情況，同時與世界口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室（WRL）、GeneBank等序列數(shù)據(jù)一起分析了我國Mya-98毒株與周邊國家毒株的遺傳關(guān)系，查明了我國Mya-98毒株的來源和主要易感動物，為今后針對性地防控該毒株提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料和毒株

采集或收集自我國2010年至2013年口蹄疫疑似病料共25份，來源于廣東省、甘肅省、山西省、江西省、貴州省、寧夏自治區(qū)、新疆自治區(qū)、西藏自治區(qū)、青海省、湖北省、遼寧省、江蘇省和四川省等13個省市區(qū)。病料通過接種敏感細(xì)胞或乳鼠傳代分離病毒。病毒培養(yǎng)物均由國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)保存。病料清單詳見表1，來源地域分布參見圖1。

表1 2010—2013年我國O型Mya-98毒株信息

1.1.2 口蹄疫抗原定型ELISA試劑盒

A、O、Asia1型口蹄疫抗原定型ELISA試劑盒由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供。

1.1.3 工具酶及試劑盒

總RNA提取試劑盒RNeasy mini Spin-Columns Kit購自德國QIAGEN公司；DNA膠純化回收試劑盒、DNA Marker、One step RT-PCR kit等購自Takara公司。

圖1 我國2010-2013年Mya-98毒株分布及區(qū)域流行圖示

1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)參考毒株序列

本研究所用中國國內(nèi)參考毒株序列由國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室（CNFMDRL）提供，中國香港、中國臺灣及世界其它國家毒株序列來自Genbank或CNFMDRL。參考毒株來源背景見表2。

表2 口蹄疫O型病毒株參考毒株

O-LAO-7-2003 老撾 2003EU667448 O-HLJOC12-03 中國 2003DQ119643 O-MOG-2004 蒙古 2004 JQ070324 O-TAI-8-2004 泰國 2004 HQ116233 O-TAI-10-2005 泰國 2005HQ116239 O-TAI-8-2005 泰國 2005 HQ116237 O-VIT-4-2005 越南 2005 HQ116278 O-MYA-2-2006 緬甸 2006HQ116225 O-MYA-1-2006 緬甸 2006JQ070316 O-LAO-4-2007 老撾 2007HQ116178 O-TAI-14-2007 泰國 2007HQ116249 O-TAI-2-2008 泰國 2008 HQ116250 O-MYA-6-2009 緬甸 2009HQ116229 O-TAI-22-2009 泰國 2009HQ116269 O-KOR-1-2010 朝鮮 2010HM143846 O-RUS-Jul-2010 俄羅斯 2010 JQ070329 O-SKR-4-2010 韓國 2010JQ070320 O-SKR-5-2010 韓國 2010JQ070321 O-SKR-12-2010 韓國 2010KC438373 O-MYA-3-2010 緬甸 2010JQ070319 O-JPN-1-2010 日本 2010 KF112885 O-HKN-7-2010 香港 2010JQ070303 O-VITYenBai-06-B 越南 2006 CNFMDRL O-VITHaiphong-06-S 越南 2006 CNFMDRL O-VITLangSon-06-Buff l o 越南 2006 CNFMDRL O-VN-YB08-2010 越南 2010 HQ260718 O-VN-YB09-2010 越南 2010 HQ260719 O-VN-YB10-2010 越南 2010 HQ260720 O-DY-CHA-2010 中國 2010 HQ652078 O-NC-CHA-2010 中國 2010 HQ652080 O-MY-CHA-2010 中國 2010 HQ652079 O-TZ-CHA-2010 中國 2010 HQ652081

1.1.5 引物

FMDV VP1基因擴(kuò)增用引物為1D2和1D5，VP1基因目的片段大小約810bp。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病料處理

將待檢病料（水泡皮、水泡液）用pH 7.40.1mol-L 磷酸緩沖液（PB）洗滌2～3次，用滅菌的濾紙吸去水分，加入石英砂及適量青霉素和鏈霉素充分研磨1:5懸液，置于4℃過夜浸毒，3000 r-m離心10 min，上清即為待檢抗原。取上清液進(jìn)行病毒分離、血清型鑒定和核酸抽提。

1.2.2 病毒的血清型鑒定

用口蹄疫病毒抗原定型ELISA試劑盒對病料或鼠毒進(jìn)行血清型鑒定。按照試劑盒說明書操作。

1.2.3 口蹄疫病毒VP1基因RT-PCR擴(kuò)增

1.2.3.1 口蹄疫病毒RNA的提取

將預(yù)處理好的病料（或病毒培養(yǎng)物），5000r-min離心2min，取上清液用于病毒RNA的提取。用QIAGEN公司RNA提取試劑盒進(jìn)行總RNA的提取。

1.2.3.2 VP1基因的RT-PCR擴(kuò)增

應(yīng)用一步法RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。以50μL反應(yīng)體系為例，在250μL的PCR薄壁管中，加入10×One Step RNA PCR Buffer 5μL，dNTP（10mM）5μL，MgCl2（25mM） 10μL，RNase 抑 制 劑1μL（40U-μL），反轉(zhuǎn)錄酶（AMV） 1μL（5U-μL），RT-PCR聚合酶 1μL（5U-μL），正向引物1D21μL（50 pmol-μL），反向引物1D51μL（50 pmol-μL），RNA模板 25μL。混勻各反應(yīng)組份，置于熱循環(huán)儀中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?2℃ 30 min，95℃ 2 min，95℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 8 min，30 個循環(huán)。

1.2.3.3 PCR產(chǎn)物檢測

PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μL產(chǎn)物在1.5% TAE瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠中含有0.5μL-mL的溴化乙錠，電泳緩沖液為1×TAE，80V～100V，15min～20min后于紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的純化、回收

用寶生物工程（大連）有限公司Agarose Gel DNA Purif i cation Kit回收DNA。操作按照說明書進(jìn)行。

1.2.5 PCR純化產(chǎn)物的測序

純化后的PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測序。測序引物與擴(kuò)增引物一致。

1.2.6 序列分析

用DNAstar（v 6.0）軟件對序列進(jìn)行分析與序列比對，應(yīng)用Treeview（v 1.6.6）進(jìn)行基因樹作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離和血清型鑒定

本研究收集的25份疑似口蹄疫均分離到口蹄疫病毒，用抗原定型ELISA試劑盒鑒定均為口蹄疫病毒O型。

2.2 口蹄疫病毒VP1基因RT-PCR擴(kuò)增

以特異性引物1D2、1D5進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得約810 bp的含有VP1基因全長目的條帶。其大小均與預(yù)期的結(jié)果相符，見圖2。

圖2 VP1基因RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3 VP1基因序列與分析

2.3.1 序列測定與比較

測序結(jié)果表明，我國豬口蹄疫O型病毒株的VP1 基因全長均為639bp，編碼213個氨基酸，未發(fā)現(xiàn)核苷酸的缺失或插入。按WRL建立的分子流行病學(xué)分析方法，對25條毒株序列進(jìn)行基因型分析，結(jié)果這些毒株均屬于SEA拓?fù)湫停▓D2）。我國Mya-98流行株VP1基因序列同源性在95%～100%之間。

以我國2010年廣東省廣州市白云區(qū)毒株（O-GDgzh-2010-S-31）為代表，其與中國香港、日本、韓國等（2010年）毒株同源性在99%左右，屬高度同源；與越南等東南亞國家（2010年）毒株同源性98.4%以上，而與我國非官方歷史Mya-98毒株（O-HLJOC12-03）同源性僅94.1%。

由此可見，我國2010年開始流行的Mya-98毒株，屬從東南亞國家傳入我國。該結(jié)果與WRL分析結(jié)果一致。

2.3.2 Mya-98毒株進(jìn)化分析

結(jié)合WRL、國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室歷年Mya-98毒株序列，Mya-98毒可分為3個遺傳組別（Group）：

組別1（G1），見于越南（1997）、緬甸（1998）、柬埔寨（1998）等國家。發(fā)病動物主要為牛。該組別毒株可能為SEA拓?fù)湫投局甑脑搭^，在后來未見相關(guān)流行報道。

組別2（G2），包括東南亞國家（如越南、老撾、緬甸、馬來西亞等2001～2008年毒株）的毒株。發(fā)病動物主要為牛，也可見豬發(fā)病，如越南毒株（O-VITHaiphong-06-S）。從WRL分子流行病學(xué)報告中發(fā)現(xiàn)，該組毒株在俄羅斯、蒙古等2010年也見有引起疫情的報道。疑惑的是，我國大陸未見由該組毒株引發(fā)的疫情報告。東南亞特有的毒株如何跨越我國大陸，在蒙古和俄羅斯等國家流行，也是備受關(guān)注的話題之一。

組別3（G3），包括我國、東南亞國家及我國周邊日本、韓國、俄羅斯、蒙古等Mya-98毒株。根據(jù)流行年代不同，又可以分為兩個不同的進(jìn)化分支（G3A和G3B）。G3A主要是2003～2005年流行毒株，如中國O-HLJOC12-03毒株，蒙古O-MOG-2004、越南O-VIT-4-2005等毒株。G3B包括我國2010年以后流行的全部毒株。G3組內(nèi)毒株同源性94%左右，分支內(nèi)毒株同源性98%以上。參見圖3。該組毒株可引起豬、牛、羊等家畜發(fā)病，宿主范圍極其廣泛。

G1與G2毒株同源性84%左右，G1與G3毒株同源性84%左右，G2與G3毒株同源性89%左右，其間最大可達(dá)到15%以上的差異，表明該毒株變異速度之快。這點(diǎn)或許是Mya-98毒株在東南亞長期流行，難以控制的原因之一。

另外，比較不同組別的Mya-98毒株發(fā)現(xiàn)，Mya-98（G3B）在VP1基因上，第47位氨基酸P-Q→S，58位S-A→P，138位E→G和198位E→A的替換，142位L→P的零星變異等等，體現(xiàn)了其共同變異特征或趨勢。雖然，關(guān)乎抗原位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸并沒有改變，但其變異位置已經(jīng)觸及關(guān)鍵位點(diǎn)或區(qū)域，或可代表了該毒株進(jìn)化的方向。

3 討論

口蹄疫M(jìn)ya-98毒株在遺傳關(guān)系上分屬于O型SEA拓?fù)湫?，因?998年前后主要在緬甸等東南亞國家流行，因此命名為Mya-98毒株。與之同屬一個拓?fù)湫偷倪€有Cam-94毒株（柬埔寨94）。Cam-94毒株主要限制在東南亞國家如柬埔寨（1994，1998）、老撾（1998）、越南（1997，1999）、馬來西亞（2001-2003）等國家流行[10-12]，近來未見由該毒株引起的疫情，我國歷史上也從未監(jiān)測到Cam-94毒株。

通過本研究表明，Mya-98毒株在東南亞等國家長期流行，于2010年前后傳入我國。但遺憾的是，由于缺少詳細(xì)的流行病學(xué)背景資料，該毒株以何路徑、以何種方式傳入我國不得而知。本文僅根據(jù)VP1基因序列分析和比較[4，13-15]，推測了我國Mya-98毒株的來源。東南亞越南、老撾、緬甸與我國接壤，邊境地區(qū)移動、動物及產(chǎn)品貿(mào)易頻繁，這些國家口蹄疫疫情傳入我國的風(fēng)險極高。而且，在東南亞國家常見由于動物移動或貿(mào)易引發(fā)的疫情[16]，這種跨區(qū)域的流行和傳播，也催生了東南亞-中國口蹄疫控制行動計劃（SEACFMD）的出臺。近年來，在全球范圍內(nèi)也常見毒株跨區(qū)域傳播流行的例子，如2011年中東地區(qū)O型PanAsia-2毒株在歐洲國家保加利亞引發(fā)疫情[17]；2012年SAT2型在北非埃及、利比亞等國家強(qiáng)勢流行[18]，甚至在亞洲如巴勒斯坦等也監(jiān)測到SAT2型毒株；2013年9月南亞Ind-2001毒株在北非利比亞等國家引發(fā)疫情。因此，如何防堵境外毒株的傳入，是我國口蹄疫防控工作面臨的一個新課題，或者說如何控制流行毒株的跨區(qū)域傳播，是今后口蹄疫防控面臨的共同難題。在我國，與之相似的情況還有2009年A型Sea-97毒株、2011年新泛亞毒株和2013年A型Sea-97 G2毒株?；仡櫸覈鼇淼目谔阋吡餍袣v史，幾乎造成大流行的毒株均來自于境外，我國防堵境外口蹄疫流行毒株的任務(wù)越來越重要。

另外，Mya-98毒株宿主適應(yīng)和轉(zhuǎn)向值得關(guān)注。2010年，我國Mya-98毒株在豬、牛、羊等均可引起發(fā)病。之后，我國再未見由該毒株引起牛發(fā)病的報道，宿主范圍表面上在縮小，但實(shí)則引發(fā)了更為嚴(yán)重的后續(xù)效應(yīng)，即豬Mya-98疫情的持續(xù)和該毒株將來在豬群中的維持和常態(tài)化。分析我國口蹄疫流行毒株與易感動物的關(guān)系可以看出，某一個毒株如果對牛易感，對豬較為鈍感，則易于控制，如2005～2009年Asia1型江蘇毒株、2009—2010年A型武漢毒株等。相反，某一個毒株如果對豬易感，則難于在短期內(nèi)控制，如CATHAY拓?fù)湫投局旰蚆ya-98毒株。因此，從Mya-98毒株目前流行潛力和對豬的易感性、致病力等方面綜合分析，該毒株在我國還將持續(xù)流行一段時期。國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室開展的全國重點(diǎn)省份豬屠宰場口蹄疫監(jiān)測結(jié)果也表明，我國豬群中Mya-98毒株較為常見，如2010年全國19省口蹄疫監(jiān)測中，在4個省市自治區(qū)屠宰場監(jiān)測到陽性帶毒；2012年全國10省豬屠宰場監(jiān)測中，在3個省監(jiān)測到豬帶毒陽性。

2010年以來，新一輪Mya-98毒株傳入我國以來，引起了嚴(yán)重的疫情流行，給我國的養(yǎng)殖業(yè)嚴(yán)重的打擊，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。自新毒株確診以來，國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室積極地投入對該毒株的研究和疫苗研發(fā)工作，并取得突破性進(jìn)展。針對該毒株的疫苗已經(jīng)投放市場，并取得了有效控制。2011年，我國發(fā)生2起Mya-98疫情，2012年發(fā)生3起，2013年僅發(fā)生2起，疫情次數(shù)（表1）和流行范圍（圖1）進(jìn)一步降低或減小?？梢钥隙ǎ灰鷮?shí)做好免疫預(yù)防、流調(diào)監(jiān)測和流通環(huán)節(jié)監(jiān)管工作，一定可以有效控制該毒株的流行。

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