非洲馬瘟VP7蛋白多克隆抗體的制備及IgM捕獲ELISA檢測方法的建立

鄭小龍，朱來華，王 群，艾 軍，鄧明俊，肖西志，梁成珠，姜 帆，于業(yè)鋒

（1.山東出入境檢驗檢疫局，山東 青島 266002；2.云南出入境檢驗檢疫局，云南 昆明 650000）

非洲馬瘟（African horse sickness，AHS）是由非洲馬瘟病毒（African horse sickness，AHSV）引起的馬屬動物的一種急性和亞急性蟲媒傳染病[1-2]。AHS可感染所有馬屬動物，但以馬最為易感，可引起動物發(fā)熱、皮下水腫及臟器出血，病死率可達90%以上。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定必須報告的動物疫病，我國將其列為一類動物傳染病。

AHS主要分布在非洲大部，另外在地中海周邊國家、中東、歐洲等也有發(fā)生，近年來該病已經(jīng)在亞洲個別國家相繼出現(xiàn)，目前我國尚未有AHS感染的報道，但隨著世界經(jīng)濟及我國對外貿(mào)易的快速發(fā)展以及賽馬參加國際比賽的機會增多，該病進入我國的風險也隨之增大。

目前已發(fā)現(xiàn)AHSV有9個血清型[3-4]，其病毒基因組包含10個dsRNA片段，編碼7個結構蛋白和3個非結構蛋白[5-6]。其中VP7結構蛋白為主要的內(nèi)衣殼蛋白，并已證實其為AHSV的群特異性抗原[7-8]，可檢測到9個AHSV血清型的抗體。本文利用VP7重組蛋白建立了檢測AHS的IgM 捕獲ELISA（MAC-ELISA）方法，為非洲馬瘟早期感染的診斷提供了技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒及特異血清 VP7原核表達質(zhì)粒由云南檢驗檢疫技術中心惠贈；陽性血清、陰性血清購自英國動物衛(wèi)生研究所（IAH）。

1.1.2 試劑 T載體、DNA連接酶 、限制性內(nèi)切 酶 Bam HI、Xho I、DNA marker， 購自大連Takara公司；rTaq DNA聚合酶、RT-PCR Taqmix、RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒購自QIAGEN公司； His-Bind?Purif i cation Kit為 Novagen公司產(chǎn)品；瓊脂糖、IPTG和DAB顯色試劑盒購自上海生工公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；羊抗馬IgM購自Abcam公司；其它試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 VP7表達載體的構建

李富祥[9]等根據(jù)VP7基因設計了一對引物用于擴增和鑒定VP基因，上游引物AH1：5’-CCC TCTAGAATGGACGCGATAGCAGCAAAG-3’（下劃線部分為Xba I酶切位點），下游引物AH2：5’-GGGAAGCTTCTAGTGGTAGGCTGCTAGC AC-3’（下劃線部分為Hind Ⅲ酶切位點），擴增片段長度為1080bp。將擴增片段插入PET-32a表達載體中，構建pET-VP7表達質(zhì)粒。

1.2.2 陽性轉化菌的誘導表達

將質(zhì)粒轉入表達菌中，然后接種于含100mmol/mL Amp的LB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。次日以10%的量接種于含Amp的LB培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)至OD600約為0.4～0.6時分別加入1.0mmol/L的IPTG進行誘導培養(yǎng)5h，取樣進行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.2.3 表達產(chǎn)物的Western-blot鑒定

將經(jīng)誘導表達的菌液處理后進行SDS-PAGE電泳，按《分子克隆實驗指南》介紹的方法進行轉印及反應，一抗采用AHSV-1型陽性血清，二抗為羊抗馬IgG-HRP。用DAB試劑顯色。

1.2.4 重組蛋白質(zhì)His-Bind柱純化

根據(jù)Novagen公司的His-Bind? Purif i cation Kit說明書進行，取不同時間的洗脫液進行電泳鑒定分析。

1.2.5 多克隆抗體的制備與標記

1.2.5.1 多克隆抗體的制備

將純化后的 pET-VP7蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合均勻，頸部皮下注射家兔（100μg/只），兩周后注射弗氏不完全佐劑與蛋白的混合液，以后每隔兩周注射一次，共免疫注射 3次后采血，收集的血清即為多克隆抗體， 用 ELISA 方法測定其效價。

1.2.5.2 多克隆抗體標記

采用Sigma HRP標記試劑盒（P8415）標記多克隆抗體。結合物酶活性和免疫反應性的鑒定，采用直接ELISA法與相應抗原進行反應，即將酶標抗體按1:103，1:104，1:105，1:106稀釋后直接與ELISA板上包被的pET-VP7進行反應，測定酶標抗體的效價并選擇其最佳工作濃度。

1.2.6 VP7抗原和血清最佳稀釋倍數(shù)的確定

1）將羊抗馬IgM用包被緩沖液作1:400稀釋，加入酶標板，每孔100μL，4℃包被過夜。

2）用洗液洗板3次，加入封閉液，每孔200μL，37℃ 2h。

3）用洗液洗板3次，將陰性和陽性血清按照1:50，1:100，1:200，1:400，1:800稀釋，每孔加100μL，37℃ 1h。

4）用洗液洗滌3次，加入pET-VP7抗原1:100， 1:200， 1:400， 1:800， 1:1600， 1:3200，1:6400， 每孔加100μL，37℃ 1h。

5） 用洗液洗滌3次，加入HRP標記的pETVP7（1:10000）抗體，每孔加100μL，37℃ 1h。

6）用洗液洗滌3次，每孔加100μLTMB，37℃ 避光 10min。

7）加入終止液，每孔加100μL，450nm讀數(shù)。

從數(shù)值中找出OD值在1.0左右，且陽性血清OD值比陰性血清OD值（P/N值）最高的作為最適稀釋度。

1.2.7 酶標抗體最佳稀釋倍數(shù)的確定

按照1.2.5中確定的抗原及血清最佳稀釋倍數(shù)，進行試驗。將抗酶標抗體作1:5000，1:10000，1:20000，1:50000，1:100000稀釋，按照上述步驟進行試驗，確定最佳稀釋倍數(shù)。

1.2.8 特異性評價

應用建立的捕獲ELISA方法對AHSV陽性血清（1-9型）、AHSV陰性血清、馬動脈炎陽性血清、馬動脈炎陰性血清、馬鼻肺炎陽性血清、WEEV陽性血清、WEEV陰性血清進行檢測，評價所建立方法的特異性。

1.2.9 重復性和穩(wěn)定性評價

根據(jù)批內(nèi)和批間的變異系數(shù)來評價捕獲ELISA方法的穩(wěn)定性。批內(nèi)差異：使用同一批次包被的酶標板對3份血清進行檢測，每份血清設置4個重復，計算其變異系數(shù)；批間差異：取4次不同時間包被的酶標板，同時對1份血清進行檢測，每塊板上設置3個重復孔，計算變異系數(shù)。

1.2.10 建立的捕獲ELISA方法與進口試劑盒比較

選取180份馬血清樣品，同時用建立的捕獲ELISA與進口試劑盒進行平行檢測，對檢測結果進行比較分析。

2 結果

2.1 重組蛋白pET-VP7的純化

將表達蛋白用His-Bind層析柱純化。取不同時間的洗脫樣品進行鑒定，由圖1可知目標蛋白仍有較高的濃度，盡管存在極少量的雜蛋白，但目標蛋白占有絕對多的含量，表明純化效果達到預期的目的。應用BCA蛋白定量試劑盒（美國Pierce公司）檢測純化蛋白含量為500μg/mL。

圖1 表達產(chǎn)物的分離與純化

2.2 Western-blot 結果

經(jīng)Western-blot 檢測，在目標條帶所處的位置（54kD左右）出現(xiàn)一條印跡（圖2），表明表達產(chǎn)物具有良好的抗原性。

圖2 表達產(chǎn)物的免疫印跡分析

2.3 多克隆抗體的制備與標記

免疫三次后采血，分離血清，將待檢血清進行10倍系列梯度稀釋，ELISA法檢測血清中抗體水平（樣品設平行）。結果顯示，經(jīng)過三次免疫后pETVP7抗體的滴度大于10-7。將純化好的血清用Sigma試劑盒進行標記，標記后直接ELISA法進行特異性檢測得知，HRP標記的抗pET-VP7抗體的工作濃度為104～105，詳細工作濃度按具體試驗而定。

2.4 VP7抗原和血清最佳稀釋倍數(shù)

根據(jù)試驗結果可知：當抗原 1:800稀釋，血清1:100稀釋時，陽性對照OD值為1.0左右，且P/N的值最大，因此我們選定抗原的稀釋倍數(shù)為1:800（0.625μg/mL），血清最佳稀釋倍數(shù)為1:100。

2.5 酶標抗體最佳稀釋倍數(shù)

將羊抗馬IgM作1:400稀釋包被酶標板，血清1:100稀釋，抗原1:800，進行試驗。結果表明當酶標抗體1:10000稀釋時，陽性對照OD值為1.1左右，且P/N的值最大，因此，酶標抗體最佳稀釋倍數(shù)為1:104。

2.6 結果判定

對已知的AHSV陽性和陰性血清進行檢測，10份陽性血清均P/N≥2.1，30份陰性血清值均P/N＜2.1，根據(jù)試驗結果，將P/N≥2.1界定為陽性，P/N＜2.1界定為陰性。

2.7 特異性評價

應用建立的捕獲ELISA方法對AHSV陽性血清、AHSV陰性血清、馬動脈炎陽性血清、馬動脈炎陰性血清、馬鼻肺炎陽性血清、WEEV陽性血清、WEEV陰性血清進行檢測，結果顯示，該方法能夠檢測出AHSV陽性血清（1-9型），特異性高，與其他病毒陽性血清無交叉反應。

2.8 重復性和穩(wěn)定性評價

應用所建立的捕獲ELISA方法進行批內(nèi)和批間重復試驗，計算其變異系數(shù)。批內(nèi)重復試驗結果顯示變異系數(shù)分別為2.31%、1.29%、4.01%；批間重復試驗結果顯示變異系數(shù)為6.21%；結果顯示批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均小于10%，說明本試驗建立的ELISA方法具有較好的穩(wěn)定性。

2.9 IgM 捕獲ELISA與進口試劑盒比較

取180份馬血清樣品分別用進口試劑盒和本研究建立的捕獲ELISA進行檢測，結果顯示，進口ELISA試劑盒檢測出的14份陽性樣品中，捕獲ELISA檢測10份為陽性，4份為陰性；進口ELISA檢測166份陰性的樣品，捕獲ELISA檢測170份為陰性。兩種ELISA均為陽性的為10份，均為陰性的為166份，因此總符合率為97.7%。

3 討論

由于非洲馬瘟目前在我國還沒有疫情發(fā)生的報道，因此我國在對該病的防控方面目前還沒有具體的措施，也沒有自主產(chǎn)權的非洲馬瘟疫苗和診斷試劑。為了防止國外疫情傳入我國，盡早開展對非洲馬瘟診斷試劑的研制，建立簡便、快速、特異、靈敏的檢測技術，對我國新興馬業(yè)的發(fā)展具有十分重要的意義。

因為IgM抗體在機體感染后最早出現(xiàn)（7-10天），因而是早期感染的重要標志性抗體。MACELISA是對常規(guī)的直接或間接ELISA的重要改進，包被抗IgM抗體的微量板可以捕獲樣品中所有類型IgM，而不同病原微生物感染僅產(chǎn)生各種特異性的IgM抗體，可結合其自身特異性微生物。在進行MAC-ELISA，只需要加入特定的抗原，就可以檢測特定的動物疾病，具有廣闊的通用性。而且IgM是早期感染引起的抗體，MAC-ELISA是早期感染診斷的重要工具，早期診斷意義重大，可以迅速采取檢疫、防疫措施，避免疫情進一步擴散。

本文通過對抗原濃度、血清稀釋度、酶標抗體稀釋度等條件進行摸索，最終確定了最佳的反應濃度及稀釋度。特異性試驗結果顯示，本文建立的MAC-ELISA方法僅能檢測出AHSV陽性血清，特異性高，與其他病毒陽性血清無交叉反應。重復性及穩(wěn)定性試驗結果顯示，批內(nèi)和批間試驗的變異系數(shù)均小于10%，說明本試驗建立的ELISA方法具有較好的穩(wěn)定性。在與進口試劑盒進行比對時，進口試劑盒檢測出的4份陽性樣品，捕獲ELISA檢測為陰性，且無法用其他方法（如中和試驗等）進行驗證，存在假陰性的問題，可能與血清采集期有關，感染后期采集的血清中IgM含量會降低。

本文建立的MAC-ELISA方法特異性強，可用于早期病毒感染產(chǎn)生的IgM抗體的檢測，且適用范圍較廣，符合出入境動物檢疫、國內(nèi)疫病疫情快速檢測的需要，為早期感染的診斷提供了一種簡便、快速、特異、靈敏的檢測手段。

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