馬屬動物梨形蟲病的PCR鑒別診斷方法研究

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（中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學重點開放實驗室，甘肅蘭州 730046）

馬屬動物梨形蟲病的PCR鑒別診斷方法研究

龔真莉，劉光遠

（中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學重點開放實驗室，甘肅蘭州 730046）

本研究基于對馬屬動物梨形蟲病18s rRNA 基因序列的分析，建立了一種PCR檢測方法。該方法可通過兩步PCR反應同步檢測馬的兩種梨形蟲?。R泰勒蟲和駑巴貝斯蟲），具有省時和敏感性較高的特點。通過實驗分別評估了此方法的特異性和敏感性，并對20份田間血樣進行檢測。試驗結(jié)果表明該方法具有較高的特異性和敏感性。對田間樣品的陽性檢測率明顯高于普通的顯微鏡觀察法。說明此方法具有較好的可行性，可以嘗試在基層實驗室推廣。

馬屬動物；梨形蟲??；PCR；診斷方法

馬屬動物是國內(nèi)僅次于牛和羊的主要家畜種群，在我國現(xiàn)有的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)條件下，馬屬動物依然是大部分農(nóng)村（特別是山區(qū)和廣大西部地區(qū)）的主要使役動物。目前，該動物的梨形蟲病流行非常廣泛，危害非常嚴重。國外對該病的研究較多，主要集中于免疫診斷和免疫預防研究，我國對這類病原研究很少，主要局限于普通臨床和病原學方面。近年來，此病在我國的流行呈上升趨勢，對畜牧業(yè)造成的危害極為嚴重，特別是一些西部貧窮地區(qū)，對馬屬動物幾乎是災難性的。

近年在甘肅中東部和青海等一些地區(qū)發(fā)生的“馬屬動物疑難病”危害極大，難以控制，在流行幾年后方確診為馬的巴貝斯蟲病。因此，建立簡便、快捷、準確、及時的分子診斷方法是十分必要的。

近年來，聚合酶鏈式反應（PCR）是一種新型的分子生物學檢測方法，使快速準確檢測馬巴貝斯蟲病成為可能[1]。并且已經(jīng)有試驗表明PCR在檢測馬的巴貝斯蟲的敏感性比顯微鏡檢測方法高[2]，比如巢式PCR和/或者原位雜交可以達到較高的敏感性。然而，這些方法仍然相對費時并且要求復雜的程序[3]。因此，有必要發(fā)展相對簡單的、適合常規(guī)實驗室快速檢測的PCR方法。本研究中，我們基于對18s rRNA基因分析，設(shè)計了三對（五條）引物，建立了一種PCR檢測方法，可通過兩步反應同步特異性檢測馬的兩種巴貝斯蟲?。R泰勒蟲和駑巴貝斯蟲）。

1 材料與方法

1.1 工具酶與試劑盒 全血基因組DNA提取試劑盒購自Gentra公司；rTaq酶、DNA連接試劑盒、DNA回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶購自Promega公司；瓊脂糖購自美國Biowest公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級產(chǎn)品。

1.2 蟲體獲得 馬泰勒蟲及駑巴貝斯蟲蟲血為實驗室保藏蟲種接種宿主動物毛驢感染獲得。

1.3 DNA提取 取少量蟲體感染血液，使用Gentra公司基因組DNA提取試劑盒，按其說明書使用步驟提取馬泰勒蟲及駑巴貝斯蟲的基因組DNA，并測定其濃度。

1.4 引物設(shè)計、PCR擴增及測序 鑒別診斷所需引物參考國外已發(fā)表的馬泰勒蟲及駑巴貝斯蟲的18S rRNA基因序列設(shè)計合成。將所獲得的基因片段經(jīng)膠回收，連接pMD18-T載體，送公司測序，最后通過BLAST分析同源性。引物合成及測序均由大連寶生物工程有限公司合成。引物序列詳見表1。

表1 擴增馬泰勒蟲和駑巴貝斯蟲的引物

PCR擴增體系（50μL）為：10×PCR buffer 5μl，dNTP mixture 4μL，上下游引物各1μL，蟲體DNA 2μL，rTaq DNA聚合酶0.5μL，加滅菌去離子水至終體積50μL?；靹蚝笾肞CR擴增儀中，擴增程序為：96℃預變性10min，94℃變性1 min，通用引物退火溫度為58℃，特異性引物退火溫度為58.5℃，退火時間均為1 min，72℃延伸40s，共35個循環(huán)后72℃延伸10 min。

1.5 特異性試驗 利用實驗室已有其它種屬動物的巴貝斯蟲基因組DNA、泰勒蟲基因組DNA及已知無此類寄生蟲與病毒感染的陰性動物全血基因組DNA進行相同條件、相同方法檢測，以檢驗此方法的特異性。

1.6 敏感性試驗 將染蟲率大致相當?shù)膬煞N蟲血提取基因組DNA，并按10倍梯度稀釋，再分別用馬泰勒蟲、駑巴貝斯蟲通用引物進行PCR擴增，判定該方法的敏感性。

1.7 田間樣品的檢測及與顯微鏡觀察方法的對比 對實驗室人工感染蟲體但經(jīng)顯微鏡檢查始終未檢出蟲體的毛驢蟲血DNA，及若干份田間發(fā)病毛驢、臨床癥狀疑似該病的樣品基因組DNA，以及實驗室確認未感染過馬屬動物巴貝斯蟲病的三份陰性動物對照樣品DNA，分別通過顯微鏡檢查及本實驗中建立的PCR方法進行檢測，對比兩者的陽性檢出率。

2 結(jié)果

2.1 蟲體基因組DNA提取 分別提取已知實驗室人工感染馬泰勒蟲和駑巴貝斯蟲單一種的毛驢蟲血基因組DNA，兩者的染蟲率均為7%～10%。并提取已知馬屬動物巴貝斯蟲陰性動物全血基因組DNA作為對照。DNA瓊脂糖凝膠電泳可見已成功獲得DNA（圖1）。測定的DNA濃度分別為10mg/mL（馬巴貝斯蟲）和2.84mg/mL（駑巴貝斯蟲）。

圖1基因組DNA電泳圖

2.2 PCR方法及測序結(jié)果分析 Bab-F和Bab-R引物對為馬屬動物巴貝斯蟲檢測的通用引物，可以同時檢測感染的兩種蟲體。此對引物擴增馬泰勒蟲和駑巴貝斯蟲的目的片段分別為960bp和906bp（圖2）。Com-Bec和Cab-R為駑巴貝斯蟲特異性引物對，目的片段約為589bp，Com-Bec和Equi-R為馬泰勒蟲特異性引物，目的片段約為420bp（圖3）。對照組均未出現(xiàn)DNA條帶。擴增獲得的各片段均進行膠回收、連接至pMD18-T載體并測序，結(jié)果表明與GenBank中登陸的基因序列（序列號為Babesia equi Z15105；Babesia caballi AY309955）的同源性均達到97%以上，此結(jié)果與實驗設(shè)計相符，說明該方法具有可行性。

圖2通用引物PCR擴增結(jié)果

圖3特異性引物PCR擴增結(jié)果

2.3 PCR方法的特異 實驗室已有其它種屬動物的巴貝斯蟲基因組DNA、泰勒蟲基因組DNA及已知陰性馬類動物全血基因組DNA進行相同條件、相同方法檢測，結(jié)果均無DNA條帶產(chǎn)生，說明此方法具有可靠的特異性（圖4）。

圖4 PCR方法特異性檢測結(jié)果

2.4 PCR方法的敏感性 分別對駑巴貝斯蟲和馬巴貝斯蟲基因組DNA進行10倍系列稀釋，同樣條件進行PCR擴增。結(jié)果表明，該方法對駑巴貝斯蟲基因組DNA的檢測下限為2.8×10-3μg/μL，對馬巴貝斯蟲基因組DNA的檢測下限為1×10-5μg/μL（圖5、圖6）。

圖5 PCR方法檢測駑巴貝斯蟲敏感性結(jié)果

圖6 PCR方法檢測馬泰勒蟲敏感性結(jié)果

2.5 田間樣品的檢測結(jié)果及與顯微鏡方法的對比通過對實驗室人工感染毛驢的3份血樣及采自青海省貴南縣部分鄉(xiāng)鎮(zhèn)的7份馬血、10分毛驢血樣分別進行PCR方法和顯微鏡鏡檢進行檢測。檢測結(jié)果表明，建立的PCR診斷方法的敏感性顯著高于傳統(tǒng)的顯微鏡檢測方法（表2）。

表2 PCR方法與顯微鏡方法的對比

3 討論

梨形蟲在自然感染病例中，診斷極為困難，目前的檢測手段非常落后，僅依靠末梢血液涂片鏡檢來確診病例，檢出率和準確率很低。同時，在血液涂片中發(fā)現(xiàn)病原時往往已是病程的中后期，錯過了病畜的最佳治療期，導致病畜愈后不良，損失嚴重。國內(nèi)大多數(shù)基層獸醫(yī)工作者對梨形蟲認識不夠，診斷困難，經(jīng)常發(fā)生誤診或診斷不及時而導致病畜愈后不良或死亡。

近年來，國外已經(jīng)報道了若干有關(guān)馬屬動物巴貝斯蟲病的PCR檢測方法。但是這些方法都有其不足之處，有的實驗程序復雜、實驗要求高，如：巢式PCR方法，ELISA檢測等方法對于基層實驗室來說存在實驗試劑、檢測儀器昂貴以及實驗時間長、對實驗人員技術(shù)要求高等缺點。目前，對于馬屬動物巴貝斯蟲病的檢測來說，特別對于發(fā)病率較高的廣大西部地區(qū)，檢測手段和實驗室儀器相對落后。所以，發(fā)展一種敏感性高、特異性好、耗時較少的適用于田間動物的快速診斷方法十分必要。

在本研究中，利用三對（五條）引物、兩個反應體系即可進行馬屬動物梨形蟲病的檢測，并且可以準確鑒別馬泰勒蟲和駑巴貝斯蟲兩個蟲種。此方法用時短，易操作，對于基層工作人員技術(shù)要求相對較低。該方法敏感性較高，可檢測隱性感染動物，可作為寄生蟲感染的早期診斷方法，有助于疾病的預防和早期治療。

[1] Bashiruddin J B， Cammà C， Rebêlo E. Molecular detection of Babesia equi and Babesia caballi in horse blood by PCR amplifcation of part of the 16S rRNA gene[J]. Vet Parasitol，1999，84（1/2）：75-83.

[2] Rampersad J， Cesar E， Campbell M D， et al .A field evaluation of PCR for the routine detection of Babesia equi in horses[J].Vet Parasitol， 2003， 114（2）：81-87.

[3] Vieira T S， Vieira R F， Finger M A，et al. Seroepidemiological survey of Theileria equi and Babesia caballi in horses from a rural and from urban areas of Paraná State， southern Brazil[J].Ticks and Tick-borne Diseases， 2013，4（6） ：537-541.

Establishment of PCR differentially diagnostic method for Equine Piroplasmosis

Gong Zhenli，Liu Guangyuan
（Key Laboratory of Animal Virology of Ministry of Agriculture， State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology，Lanzhou Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou， Gansu 730046）

In this study，a PCR assay was developed based on the analysis of 18s rRNA gene sequences of Babesia equi and Babesia caballi. This method could be performed by a two-step PCR reaction to detect the two piroplasmosis （Babesia equi and Babesia caballi ）， with high sensitivity and time-saving. The specifcity and sensitivity of the method were evaluated， and 20 feld blood samples were tested. The results showed that the method was of high specifcity， sensitivity and stability. Positive detection rate in the feld samples with this method was signifcantly higher than that with the ordinary microscope method indicating good feasibility for promotion in the grassroots laboratory.

Equine；Piroplasmosis；PCR；diagnostic method

S852.723；S858.21

：A

：1005-944X（2014）05-0074-04