肝豆?fàn)詈俗冃缘幕蛟\斷☆

劉磊磊 湯其強(qiáng) 韓若東 肖晗

肝豆?fàn)詈俗冃缘幕蛟\斷☆

劉磊磊*湯其強(qiáng)*韓若東△肖晗*

肝豆?fàn)詈俗冃曰蛟\斷WD基因

肝豆?fàn)詈俗冃杂址Q威爾遜病（Wilson's disease，WD），系常染色體隱性遺傳性銅代謝障礙疾病。世界范圍發(fā)病率為1/10萬-1/3萬[1]，雜合子頻率為1/100～ 1/200[2]，其中中國是高發(fā)區(qū)。該病是由于ATP7B基因突變，導(dǎo)致銅轉(zhuǎn)運(yùn)P型ATP酶缺失，從而導(dǎo)致血漿銅藍(lán)蛋白降低及銅在體內(nèi)器官的沉積等一系列臨床表現(xiàn)。WD是目前少數(shù)可以治療的神經(jīng)遺傳病之一，患者如果能在發(fā)病早期或癥狀前期即被確診并得到及時治療，大多預(yù)后良好，反之病情逐漸加重甚至危及生命[3]。目前臨床上多是根據(jù)患者臨床表現(xiàn)結(jié)合銅生化檢測加以診斷，但并非所有患者都有生化方面的變化，大約40%的癥狀前期患者每天尿排銅量小于100μg，并且尿銅含量增高出現(xiàn)相對較晚，因此基因診斷至關(guān)重要[4]。基因診斷是WD病的最為明確、有效的診斷方法，對患者的家系成員，尤其是同胞應(yīng)早期進(jìn)行ATP7B基因突變篩查，有望檢出癥狀前患者或輕癥患者。本文就WD病的基因診斷技術(shù)做一綜述。

1 傳統(tǒng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)

目前對WD病多采用以下標(biāo)準(zhǔn)[5]：①家族遺傳史：父母是近親婚配，同胞有WD患者或死于原因不明的肝??；②緩慢進(jìn)行性震顫、肌僵直、構(gòu)音障礙等錐體外系癥狀、體征或/和肝癥狀；③肉眼或裂隙燈證實有K-F角膜色素環(huán)；④血清銅藍(lán)蛋白＜200mg/L或血清銅氧化酶＜0.2活力單位；⑤24 h尿銅排泄量＞100μg(1.56μmol)；⑥肝銅＞250μg/g(干重)。判斷：凡完全具備上述①～③項或l及4項者，可確診為臨床表現(xiàn)型；具備③～⑤者或③～④項者屬癥狀前型。僅有①～②項或①、③項者，應(yīng)懷疑WD，通過第⑥項確診。

2 基因檢測方法

2.1 家系連鎖分析 其原理是將待檢家族成員基因與先證者的遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因連鎖分析，從而進(jìn)行診斷。方法包括限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)和單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）。1989年Figus等[6]首先采用RFLP法開始了WD的基因診斷，成功地在WD先證者家系中篩選到癥狀前患者和雜合子。RFLP法是早期的基因檢測方法，但因其信息量少等原因而不適用于臨床。STR又稱微衛(wèi)星DNA，與RFLP相比，具有分布廣泛、高多態(tài)性、高雜合性、易于確定基因型等優(yōu)點。Thomas等[7]利用微衛(wèi)星DNA對WD患者家系進(jìn)行分析，表明該標(biāo)記也可用于WD先證者家系成員的診斷，且檢出率更高。國內(nèi)王麗娟等[8]也利用5個微衛(wèi)星DNA標(biāo)記對22個WD進(jìn)行了單倍體連鎖分析，取得了滿意的結(jié)果。孟曉燕等[9]運(yùn)用多個短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)多態(tài)性位點單體型分析析對肝豆?fàn)詈俗冃?WD)攜帶者進(jìn)行篩查及產(chǎn)前診斷，檢測D13S296、D13S301和D13S316 3個位點，證實該方法準(zhǔn)確快速。以上方法所用酶DNA遺傳標(biāo)記與WD基因距離較遠(yuǎn)、重組率高，且必須與同一家系的先證者進(jìn)行比較，因此不能用于無先證者的擬診患者。

DNA序列單個堿基的差別可造成DNA片段構(gòu)象變化而作為多態(tài)性標(biāo)記，稱單核苷酸多態(tài)性（SNP）。2007年Harmut[10]、Gupta等[11]選擇了4個WD基因的SNP位點對印度人WD家系進(jìn)行檢查，檢測效果較好，證明SNP具有遺傳穩(wěn)定、重組率低等特點。若將其與PCR、RFLP等方法結(jié)合起來可大大提高基因診斷效率。

2.2 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）分析技術(shù) PCR分析技術(shù)方法包括聚合酶鏈反應(yīng)一單鏈構(gòu)象多態(tài)性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)；PCR酶切和熒光PCR技術(shù)，多重PCR等。PCR-SSCP靈敏度較離，適用于單個堿基插入、置換或缺失的檢測。操作相對簡單費(fèi)用較低，但由于不能明確突變部位和性質(zhì)，且易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果。多用于突變的篩選，其最終結(jié)果需經(jīng)DNA測序證實。1997年Maier-Dobeersberger等[12]以半巢式PCR酶切分析法率先開展了對WD直接基因診斷的嘗試，針對14號外顯子His1069Gln進(jìn)行突變篩選而檢出癥狀前患者和雜合子。此后國內(nèi)馬少春等以Msp I酶切法對8號外顯子778密碼子突變進(jìn)行了檢測[13]，隨后黃帆等以熒光PCR法對Arg778Leu突變進(jìn)行檢測[14]，均取得了滿意的結(jié)果。國內(nèi)針對8號外顯子的突變熱區(qū)采用酶切分析、熒光聚合酶鏈反應(yīng)等方法進(jìn)行基因突變位點的檢測，陽性檢出率為27.00%，39.40%。PCR酶切和熒光PCR技術(shù)只能對已知的突變點基因檢測，且需要設(shè)計針對特異突變的探針，不能檢測未知的突變位點，限制了其臨床應(yīng)用。

多重擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR（multiplex amplification refractory mutation system PCR，M-ARMS-PCR）：ARMS自1989年問世以來已被用來檢測多種基因的已知點突變，其原理是PCR擴(kuò)增時引物是否能延伸主要取決于引物3’端的1～2個堿基是否與模板配對，如果不配對則引物不能延伸，故只要能設(shè)計適當(dāng)?shù)囊?，則可以區(qū)別正常和突變的DNA順序。在ARMS基礎(chǔ)上設(shè)計多重PCR，可同時檢測多種突變。Hassan Dastsooz等[15]使用M-ARMS-PCR篩查ATP7B的常見突變點，其結(jié)果證明M-ARMS-PCR高效、準(zhǔn)確、費(fèi)用低廉，可用于臨床上篩查ATP7B常見突變點。

2.3 變性高效液相色譜（DHPLC）分析技術(shù) DHPLC于20世紀(jì)90年代末出現(xiàn)，其原理是由于同源雙鏈和異源雙鏈二者間雙鏈熔解溫度(Tm)的差異，形成不同的色譜峰，從而發(fā)現(xiàn)已知的和未知的DNA變異。DHPLC是一種高通量的篩選DNA序列變異的技術(shù)，具有較高的敏感性和特異性，且操作簡單，有快速、敏感、準(zhǔn)確且經(jīng)濟(jì)的特點，陽性檢出率可達(dá)33.32%，但此法不能確定基因突變部位和性質(zhì)，只適用于大樣本篩查。

2.4 DNA測序技術(shù) WD基因全序列檢測是目前WD基因診斷中最常用、最準(zhǔn)確、最直接的的方法，可確定基因突變的具體位置和性質(zhì)，是WD基因診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，DNA測序不斷朝著高通量、高速、自動化的方向發(fā)展。目前采用WD全外顯子測序進(jìn)行基因檢測的方法已經(jīng)十分成熟，可以發(fā)現(xiàn)各外顯子以及其與內(nèi)含子交界處的突變，檢測費(fèi)用也為多數(shù)患者家庭接受。通過精確的臨床診斷和迅速的全基因測序，ATP7B基因的突變檢測率可達(dá)98%[16-17]。但是基因檢測對技術(shù)人員要求高、設(shè)備要求高、在一般醫(yī)院難以推廣。

2.5 DNA微陣列技術(shù) 也稱為DNA芯片技術(shù)，該技術(shù)通過將含突變點的及正常的DNA序列片段均集成于一個芯片之上實現(xiàn)對突變的快速準(zhǔn)確的檢測而完成WD基因診斷。該技術(shù)具有高通量、多樣化、微量化、集成化等顯著優(yōu)點[18]。Harmut等開發(fā)了一種可以檢測60種WD基因突變的DNA微陣列芯片，但仍不能包含一些少見的和新發(fā)現(xiàn)的突變[10]。

2.6 高分辨率溶解曲線分析（high-resolution melting，

HRM） HRM是于2002年由猶他大學(xué)和愛德華科技公司合作開發(fā)的應(yīng)用于SNP檢測分析的一項新技術(shù)。其原理是基于單核苷酸熔解溫度不同而形成不同形態(tài)熔解曲線。相較于傳統(tǒng)的基因檢測技術(shù)，HRM不僅據(jù)有極高的特異性和理想的靈敏度，而且成本低、通量高、速度快、結(jié)果準(zhǔn)確、不受檢測位點的局限，并且實現(xiàn)真正無污染的閉管操作。在突變掃描、單核苷酸多態(tài)性分析、甲基化研究、基因分型、序列匹配等方面HRM分析技術(shù)發(fā)揮著重要作用。Chin-Wen Lin等[19]用HRM法篩查臺灣地區(qū)14名WD患者及50名正常人的ATP7B基因，發(fā)現(xiàn)10種不同的熱點突變及7種基因多態(tài)性，并在50名正常人種發(fā)現(xiàn)一種新的變異序列(p.A476T)及一種新的基因多態(tài)性(p.L776L)，此結(jié)果經(jīng)直接DNA測序得以證實。

3 小結(jié)

ATP7B基因位于13q14.3，全長約80kb，包含21個外顯子20個內(nèi)含子、4.3kb編碼區(qū)，以點突變?yōu)橹?，至今為止已發(fā)現(xiàn)600多種突變，大多是雜合突變[20]，了解這些突變譜對基因檢測至關(guān)重要。WD分子遺傳學(xué)檢測面臨的主要困難是檢測的靈敏度和如何從良性序列中識別出致病性序列。Kenney SM等[21]于2007年報道在WD的518種突變中，379種是致病性的，139種為非致病性的，還有一些突變體尚不能確定是否致病。

毫無疑問，上述的基因診斷方法對銅生化檢測難以確診的臨床WD患者及癥狀前患者或雜合子的檢出取得了一定的效果。但由于突變類型的復(fù)雜多樣，有相當(dāng)部分患者難以檢出。而一種理想的診斷方法應(yīng)有很高的診斷率和盡可能低的誤診率（假陽性）及漏診率（假陰性）。

除WD基因本身異常外，其調(diào)控或表達(dá)異常也會致病。WD基因本身存在選擇性剪切現(xiàn)象，且有些基因突變對基因表達(dá)并無影響[22]，因而對WD基因表達(dá)產(chǎn)物的數(shù)量和結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測可能更有意義。通過對mRNA的檢測，可以了解有無WD基因的轉(zhuǎn)錄及加工缺陷等。另外，即使WDmRNA的轉(zhuǎn)錄完全正確，WD的正確表達(dá)還有賴于正確的翻譯及翻譯后加工（糖基化）。因此WD蛋白分子水平檢測判斷其含量，結(jié)構(gòu)與功能有無異常也許是WD分子水平診斷的最佳發(fā)展方向。

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10.3936/j.issn.1002-0152.2014.04.015

☆ 安徽省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研課題（編號：2010B003）*

安徽省立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（合肥230001）

（E-mail:tqq1995＠126.com）△亳州市第一人民醫(yī)院

R742.4 (

2013-08-02）

A （責(zé)任編輯:李立）

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