石菖蒲對(duì)腦缺血大鼠紋狀體氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量變化的影響*

張衛(wèi)同，柴 棟，徐 珊，劉 萍△，劉 坤

缺血性腦血管病是老年人中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見疾?。?］，目前由于許多藥物不能通過血腦屏障或通過量較少而達(dá)不到控制疾病的作用，因此治療效果差。研究顯示，無論何種原因引起的缺血性腦血管病均可導(dǎo)致腦組織缺血缺氧性改變，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)元損傷和死亡、腦組織壞死軟化，從而產(chǎn)生相應(yīng)腦功能缺損的臨床癥狀。

在中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，腦缺血屬竅閉類疾病中的寒閉證，閉證一般用開竅藥協(xié)助治療。開竅藥之一的石菖蒲是天南星科植物石菖蒲（Acorus tatarinowiiSchott）的干燥根莖。味辛性溫，行散之力強(qiáng)，既能芳香化濕、醒脾健胃，又可化濁祛痰、開竅寧神，是芳香寧神、滌痰開竅之要藥，臨床上廣泛用于癲癇、痰厥、熱病神昏、健忘、中風(fēng)失語(yǔ)、耳鳴、老年性癡呆等病癥。石菖蒲成分復(fù)雜，但其中的欖香烯、β-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚3種物質(zhì)是其透過血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的主要成分［2］。石菖蒲提取液可使BBB內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接疏松，并且能使小鼠腦內(nèi)伊文思蘭及苯妥英鈉的含量顯著高于空白組［3］。這些研究揭示石菖蒲促進(jìn)BBB開放的藥理作用，也為本實(shí)驗(yàn)的開展提供了理論基礎(chǔ)。開竅藥石菖蒲對(duì)腦缺血大鼠腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的干預(yù)也同時(shí)能反映其對(duì)腦損傷組織的保護(hù)作用。

近些年發(fā)展起來的被廣泛地應(yīng)用于藥物代謝和神經(jīng)生化分析的微透析（microdialysis，MD）技術(shù)為本研究提供了良好的技術(shù)保障［4］。我們采用大鼠建造腦缺血模型，觀察腦缺血大鼠紋狀體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)天門冬氨酸（aspartic acid，Asp）、谷氨酸（glutamic acid，Glu）、甘氨酸（glycine，Gly）和γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyricacid，GABA）在大鼠腦紋狀體中的含量變化及石菖蒲的干預(yù)，以期為調(diào)節(jié)腦內(nèi)氨基酸類遞質(zhì)，減少對(duì)腦缺血后影響提供依據(jù)。與本文相關(guān)的研究以往未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

冰片（Sigma公司，批號(hào)：101129341）；石菖蒲飲片（解放軍總醫(yī)院中藥房提供）；Asp、Glu、Gly標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物檢定所；GABA標(biāo)準(zhǔn)品、鄰苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）、β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol）均購(gòu)于 Sigma公司；磷酸氫二鈉（J.T.Baker公司）；其他均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

腦立體定位儀（中國(guó)，深圳瑞沃德生命科技有限公司）；腦微透析探針（瑞典，CMA公司）；CMA-400型針管式微量注射泵（瑞典，CMA公司）；牙科鉆（美國(guó)，silite公司）；Agilent1200型HPLC儀（美國(guó)Agilent公司），G1311A系列四元梯度泵，G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1321A熒光檢測(cè)器，HP Rev.A.0501化學(xué)工作站，色譜柱為 Agilent，ZORBAX Eclipse XDB-C18（5 μm，250mm×4.6 mm）；pH計(jì)，磁力攪拌器，循環(huán)水真空泵，KQ2200DB型數(shù)控超聲波清洗器，電子天平，超低溫冰箱，揮發(fā)油提取器，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康SD雄性大鼠24只，體重（340～360）g，合格證號(hào)：SCXX（京）2006-0009，由北京大學(xué)第三醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將大鼠分為4組（n＝6）：正常對(duì)照組（Ⅰ）：給蒸餾水；腦缺血模型組（Ⅱ）：給蒸餾水；假手術(shù)組（Ⅲ）；藥物組（Ⅳ）：造缺血模型前給石菖蒲全煎液，每只1.5ml（相當(dāng)于生藥量7.5 g／kg）；各組大鼠均以灌胃方式給藥。

1.3.2 石菖蒲提取液的制備 取石菖蒲飲片300 g，加7倍量水，按《中國(guó)藥典》2010版一部附錄揮發(fā)油提取法甲法，保持微沸狀態(tài)約5 h，至揮發(fā)油提取器中的油量不再增加，停止加熱，放置片刻，開啟提取器下端的活塞，將水緩緩放出，至油層下液面為止，收集揮發(fā)油提取率為1.5%，藥渣加水兩次，分別為6，8倍，各煎煮30 min，棄去藥渣，水煎液合并，濃縮至295ml，將所得揮發(fā)油和水煎液混合均勻，含量為1 g／ml即得。

1.3.3 人工腦脊液（aCSF）的配制 分別?。篘aCl 7.36 g，CaCl20.12 g，NaHCO32.31 g，MgCl20.17 g，KCl 0.18 g，Na2SO40.07 g，KH2PO40.07 g，加入1 000ml蒸餾水，溶解后調(diào) pH 7.38，再經(jīng)孔徑0.2μm水系微孔濾膜抽濾即得，冰箱內(nèi)冷藏備用。

1.3.4 四種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液的標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取Asp，Glu，Gly，GABA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品各 5.0 mg，各用 0.1 mol／L的鹽酸溶液定容在10ml的容量瓶中，振蕩混勻，得0.5mg／ml標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，再分別精密量取2 ml標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用50%的甲醇定容置50 ml的容量瓶定容成20μg／ml的四種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液，然后用 50%的甲醇釋制成質(zhì)量濃度為（10.0，5.0，2.5，1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125，0.015625）μg／ml的混合氨基酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別用不同濃度的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液直接在HPLC儀上進(jìn)行測(cè)定，色譜條件與測(cè)量樣品時(shí)一致，每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)液連續(xù)進(jìn)樣檢測(cè)3次。以進(jìn)樣量的神經(jīng)遞質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，利用回歸方程計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線，Asp、Glu、Gly、GABA的標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性系數(shù)分別為 Y＝111.88X＋9.3523（r＝0.999600），Y＝122.25X＋4.93（r＝0.099980），Y＝223.96X＋34.841（r＝0.99979），Y＝215.9X＋25.948（r＝0.99995）并繪圖（圖 1）。

1.3.5 衍生試劑的制備 精密稱定12.5 mg OPA，加 0.25ml甲醇溶解，加入 2.5 ml硼酸緩沖液（0.4 mol／L，pH 9.5），渦旋混勻后加入 30μlβ-巰基乙醇，冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 動(dòng)物開顱手術(shù) 大鼠用10%水合氯醛按3.45ml／kg腹腔注射麻醉后，置立體定位儀上，下墊恒溫墊，上耳桿，固定門齒，切開頭皮，暴露頭骨，參照《大鼠腦立體定位圖譜》［5］，根據(jù)坐標(biāo)位置顱骨鉆孔，在立體定向儀下旋轉(zhuǎn)垂直臂將微透析探針導(dǎo)軌植入腦紋狀體區(qū)，并在顱骨外鉆孔周圍區(qū)域呈三角形對(duì)稱擰入三顆螺釘后用牙托粉將導(dǎo)軌與螺絲釘固定成一體，插入探針。

Fig.1 Standard curve of Asp，Glu，Gly，GABA by HPLCASP：Aspartic acid；Glu：Glutamic acid；Gly：Glycine；GABA：γ-aminobutyric acid

1.3.7 模型建立與樣品采集 開啟微透析灌流系統(tǒng)，以aCSF做灌流液，調(diào)節(jié)微量注射泵控制灌流液流速恒定為2.0μl／min。待腦探針植入紋狀體后，穩(wěn)定平衡90min，每20 min收集透析液。收集第一管樣品1 h后，分離雙側(cè)頸動(dòng)脈，用線栓法結(jié)扎頸動(dòng)脈，完成腦缺血模型（陰性對(duì)照組、單純給藥組不做任何干預(yù)措施；假手術(shù)組，只分離頸動(dòng)脈，不結(jié)扎）。干預(yù)后共收集12管透析液，收集的樣品即刻轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。透析結(jié)束后，大鼠麻醉，斷頭取腦，用組織學(xué)方法驗(yàn)證透析探針取樣位置，若探針膜錯(cuò)位或腦損傷過重，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果不計(jì)。

1.3.8 色譜柱前衍生化 抽取衍生化試劑和樣品溶液各10.0μl混合進(jìn)樣，在線柱前衍生，反應(yīng) 1.5 min，速率為 200μl／min。

1.3.9 熒光檢測(cè)器檢測(cè)條件 激發(fā)波長(zhǎng)340 nm，發(fā)射波長(zhǎng) 450 nm；流動(dòng)相：磷酸緩沖液（0.1 mol／L，Na2HPO4配制，pH 6.86）→甲醇 ＝70∶30，梯度洗脫；流速：1.0ml／min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10μl。

四種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品出峰順序及時(shí)間分別為Asp 4.305 min，Glu 5.675 min，Gly 17.955 min，GABA 27.227min（圖 2）。

1.3.10 精密度測(cè)定 精密吸取濃度為5μg／ml對(duì)照品液，以相同的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣8次，測(cè)得Asp，Glu，Gly和 GABA的峰面積 RSD分別為2.3016，1.4289，0.4151，1.2565，峰遷移時(shí)間的 RSD分別為0.0553，0.0619，0.0838，0.0618，均小于 2.5%。

1.3.11 探針回收率測(cè)定 取樣前將探針置于50 μg／ml的混合對(duì)照品溶液中，以與腦內(nèi)微透析相同的灌流液、灌流速度和時(shí)間間隔收集體外透析液，并按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，Asp，Glu，Gly，GABA的體外探針回收率分別為20%，17.5%，20%，20%。

Fig.2 HPLC chromatogram map of Asp，Glu，Gly，GABA standardsASP：Aspartic acid；Glu：Glutamic acid；Gly：Glycine；GABA：γ-aminobutyric acid；HPLC：High performance liquid chromatography

1.3.12 樣品含量測(cè)定 利用以上建立的方法，測(cè)定不同采樣時(shí)間點(diǎn)大鼠腦紋狀體區(qū)微透析樣品中4種氨基酸含量，缺血組腦透析樣品HPLC色譜圖如下（圖 3）。

Fig.3 HPLC chromatogram map of Asp，Glu，Gly，GABA in the dialysate in the striatum in 40min after cerebral ischemia ASP：Aspartic acid；Glu：Glutamic acid；Gly：Glycine；GABA：γ-aminobutyric acid；HPLC：High performonce liquid chromatography

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

根據(jù)以上建立的分析方法，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每只動(dòng)物給藥后每個(gè)樣品各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的測(cè)定值濃度，統(tǒng)計(jì)每組動(dòng)物的透析濃度（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）；所測(cè)數(shù)據(jù)使用SPSS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用組間 t檢驗(yàn)并進(jìn)行方差分析比較，分析各組氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)在紋狀體中的含量變化。

2 結(jié)果

2.1 腦缺血后4種氨基酸含量變化趨勢(shì)

4種氨基酸在40 min內(nèi)均得到較好的分離，且不受腦透析樣品中其他雜質(zhì)的干擾。與正常對(duì)照組相比，在完成缺血模型后，4種氨基酸含量顯著變化，腦缺血大鼠紋狀體內(nèi)Asp、Glu、Gly、GABA均顯著升高（P＜0.01）。

2.2 石菖蒲對(duì)4種氨基酸的影響

對(duì)缺血腦紋狀體內(nèi)Asp水平，石菖蒲給藥組與對(duì)照組相比基本持平，缺血組與對(duì)照組相比，含量明顯降低（P＜0.01，圖 4），對(duì)缺血腦紋狀體內(nèi) Glu水平，石菖蒲給藥組含量明顯低于對(duì)照組與缺血組（P＜0.01，圖 5），這說明石菖蒲有降低 Asp、Glu的功效，達(dá)到減少興奮性氨基酸（excitatiory amino acids，EAAs）的神經(jīng)毒性的作用。石菖蒲給藥對(duì)腦缺血大鼠紋狀體區(qū)抑制性氨基酸類（inhibitory amino acids，IAAs）甘氨酸水平隨腦缺血時(shí)間延長(zhǎng)緩緩升高，在3 h左右達(dá)最高，大鼠腦缺血后，紋狀體區(qū)γ-氨基丁酸的含量升高，與對(duì)照組相比有極顯著差異（P＜0.01，圖 6），與缺血組相比 140 min前無顯著性差異，以后比缺血組還高（P＜0.05，圖 7）。130 min后缺血組抑制性氨基酸含量均有所下降，170 min后重新上升，210min后均又下降，而給藥組呈緩慢持續(xù)地上升，3 h后依然維持高水平（圖6，圖7）。

Fig.4 Effectsof Acorus tatarinowiiSchotton the contentofaspartic acid in the striatum after cerebral ischemia**P＜0.01 vs control group

Fig.5 Effects of Acorus tatarinowii Schott on the content of glutamic acid in the rat striatum after cerebral ischemia*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group

3 討論

本實(shí)驗(yàn)從神經(jīng)藥理學(xué)的角度采用腦微透析技術(shù)檢測(cè)大鼠腦局部缺血時(shí)紋狀體內(nèi)四種神經(jīng)遞質(zhì)Glu、Asp、Gly、GABA的變化，探索了中藥開竅藥石菖蒲和氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)變化的相關(guān)性。通過這些研究，觀察到開竅藥石菖蒲能降低EAAs的神經(jīng)毒性，不僅能透過BBB，同時(shí)對(duì)缺血腦組織也有保護(hù)作用。

Fig.6 Effects of Acorus tatarinowii Schott on the content of glycine in the rat striatum after cerebral ischemia*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group

Fig.7 Effects of Acorus tatarinowii Schott on the content ofγaminobutyric acid in the rat striatum after cerebral ischemia*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group

近年研究證實(shí)，神經(jīng)元釋放的多種氨基酸對(duì)缺血性腦損傷起重要作用，在這些氨基酸中，EAAs遞質(zhì) Glu、Asp尤為重要［6，7］。腦缺血時(shí)除了缺血中心出現(xiàn)組織壞死，其缺血區(qū)域周圍的神經(jīng)細(xì)胞也會(huì)出現(xiàn)緩慢壞死，Glu過度釋放能通過激動(dòng)N-甲基-D-天冬氨酸（N-methy-D-aspartate，NMDA）、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid，AMPA）受體和代謝性谷氨酸受體，影響離子通道，調(diào)節(jié)Ca2＋內(nèi)流，導(dǎo)致神經(jīng)元的Ca2＋內(nèi)流增加。不適當(dāng)?shù)腃a2＋內(nèi)流可引起神經(jīng)細(xì)胞壞死或者凋亡，造成腦缺血損害。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)大鼠腦缺血后，腦紋狀體區(qū)氨基酸遞質(zhì)是升高的，可暫時(shí)產(chǎn)生對(duì)腦組織的保護(hù)作用，但時(shí)間過長(zhǎng)將會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)毒性。特別是EAAs含量持續(xù)性升高，對(duì)腦有一定損害作用，而應(yīng)用開竅藥石菖蒲是通過降低EAAs起到腦保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)顯示，在腦缺血狀態(tài)下給予開竅藥石菖蒲后，氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)與對(duì)照組相比變化顯著，說明石菖蒲的有效成分可以透過BBB，并可降低腦缺血時(shí) Asp、Glu含量，從而減少EAAs對(duì)腦的的毒性。

此外，IAAs遞質(zhì)Gly和GABA也對(duì)腦缺血損傷后果有明顯影響［9］。GABA是典型的 IAAs，其受體主要有3種，分別為 GABAA、GABAB和 GABAC受體。GABAA為配體-門控Cl-通道，興奮時(shí)Cl-內(nèi)流增加；GABAB為G蛋白偶聯(lián)受體，興奮時(shí)K＋通道電導(dǎo)增加，減少Ca2＋內(nèi)流。而GABA升高對(duì)大鼠海馬腦片缺氧損傷有保護(hù)作用［9］。石菖蒲促進(jìn) IAAs保持高表達(dá)，降低腦缺血后繼發(fā)神經(jīng)元的損傷。說明對(duì)腦缺血時(shí)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的改變產(chǎn)生了干預(yù)。通過干預(yù)神經(jīng)遞質(zhì)途徑對(duì)腦缺血組織起到保護(hù)作用，這種腦保護(hù)性機(jī)制可能是芳香開竅藥開竅機(jī)理之一［10］，類似于興奮性氨基酸受體拮抗劑作用。具體的藥理學(xué)機(jī)制正在進(jìn)一步研究中。

由于樣品收集時(shí)間較短，未完全得到缺血持續(xù)狀態(tài)下藥物代謝過程中對(duì)缺血腦紋狀體內(nèi)4種氨基酸影響的動(dòng)力學(xué)變化。本實(shí)驗(yàn)對(duì)研究開竅藥抑制腦缺血區(qū)域神經(jīng)毒性和保護(hù)腦缺血組織提供了可行的研究思路和實(shí)驗(yàn)方法。

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