STIM 2、TRPC3在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞外鈣敏感受體介導(dǎo)的鈣內(nèi)流和NO生成中的作用*

王 靜，鐘 華，趙 慧，王臘梅，龐麗娟，孫志萍，何 芳△

近年來(lái)，圍繞鈣通道蛋白在不同組織細(xì)胞中經(jīng)鈣池操縱的鈣離子通道（store-operates cation channels，SOC）介導(dǎo)的生理和病理生理作用展開(kāi)了大量研究。在哺乳動(dòng)物中，Ca2＋感受蛋白基質(zhì)相互作用分子（stromal interactionmolecule，STIM）有兩種蛋白：STIM1和STIM2。研究發(fā)現(xiàn)STIM1為鈣庫(kù)操縱的鈣內(nèi)流（store operated calcium entry，SOCE）必不可少的調(diào)節(jié)蛋白。而STIM2是STIM1的同系物，STIM2與STIM1分享全部蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域并與STIM1組成異型多聚體［1］，在基礎(chǔ)狀態(tài)下，STIM2在維持及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度（intracellular Ca2＋concentration，［Ca2＋］i）的過(guò)程中起重要作用。C型瞬時(shí)型感受器電位（transient receptor potential canonical，TRPC）超家族中共有7個(gè)成員（TRPC1 7），他們均表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞。TRPC3作為其中的一種亞型，可參與多種疾病病理生理過(guò)程。在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）由 TRPC1／TRPC3異源二聚體構(gòu)成 SOC［2］。

鈣敏感受體（Ca-sensing receptor，CaR）為G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein-coupled receptor，GPCR）超家族中C亞族的成員。在HUVEC中，CaR可經(jīng)SOC發(fā)揮介導(dǎo) Ca2＋內(nèi)流和 NO生成的作用［3-4］，且 TRPC1和STIM1為參與上述過(guò)程的關(guān)鍵組件之一（文章已整理投稿），那么 STIM2、TRPC3是否參與CaR介導(dǎo)的Ca2＋內(nèi)流和NO生成？本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上以原代培養(yǎng)的HUVEC為研究對(duì)象，構(gòu)建STIM2和TRPC3RNA干擾質(zhì)粒，并觀察STIM2和TRPC3基因沉默，HUVEC中［Ca2＋］i和 NO生成的變化，以證明STIM2和TRPC3在 CaR介導(dǎo)的［Ca2＋］i和 NO生成中的作用，為心腦血管疾病的防治提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

健康孕婦剖宮產(chǎn)的新鮮臍帶（來(lái)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，經(jīng)倫理道德委員會(huì)批準(zhǔn)和個(gè)人知情同意）。

1.2 主要試劑

ECM培養(yǎng)基（Sciencell）；蛋白酶抑制劑（Calbichem）；兔抗人TRPC3多克隆抗體、鼠抗β-Actin單克隆抗體（Santa Cruze）；鼠抗人 STIM2多克隆抗體（Cell signaling）；二抗（Protein Tech）；ECL發(fā)光試劑盒（Thermo）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與Real time RT-PCR試劑盒（TaKaRa）；LipofectamineTM2000與 Opti-MEM（Invitrogen）；Fura-2／AM（Invitrogen）；DAF-FM DA（NO熒光探針）（Beyotime）；G418（Biosharp）、去內(nèi)毒素高純度質(zhì)粒抽提試劑盒（Omega）；shRNA（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司）；引物（友名生物技術(shù)有限公司）；其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 主要方法

1.3.1 HUVEC的培養(yǎng)與鑒定 依據(jù)本研究室以前的方法培養(yǎng) HUVEC并傳代［3］，用細(xì)胞內(nèi)Ⅷ因子相關(guān)抗原進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，鑒定HUVEC，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的2～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 免疫熒光檢測(cè)HUVEC中STIM2與TRPC3的蛋白表達(dá) 將細(xì)胞接種在玻片上，孵育24 h，用PBS溶液沖洗細(xì)胞三次，冰甲醇固定。含0.2%Triton的PBS沖洗細(xì)胞兩次，0.5%Triton加入細(xì)胞中，室溫下破膜15min后用含0.2%Triton的 PBS洗5 min，5%BSA封閉40min。保持細(xì)胞濕度，加一抗，4℃冰箱中孵育。第二天加入二抗，避光孵育細(xì)胞1 h，0.2%Triton的 PBS洗 5 min后加核染料 DAPI（1：1 000）室溫避光孵育 15 min，含 0.2%Triton的 PBS洗5min，熒光顯微鏡觀察并記錄結(jié)果。

1.3.3 TRPC3、STIM2基因的 shRNA構(gòu)建及轉(zhuǎn)染（1）根據(jù)shRNA的設(shè)計(jì)原則，GenBank中人TRPC3的cDNA序列（NM-003305）、人 STIM2的 cDNA序號(hào)（NM-020860），分別以其同源的編碼DNA序列部分設(shè)計(jì)、合成3條shRNA。上述序列經(jīng)BLAST軟件分析，與人類(lèi)基因外顯子無(wú)同源性，排除對(duì)其他基因非特異性干擾，并與載體連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒。（2）轉(zhuǎn)染：細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分為未轉(zhuǎn)染組即空白對(duì)照組（control組）、空質(zhì)粒組（vehicle組）和特異性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組即實(shí)驗(yàn)組（TRPC3shRNA和STIM2shRNA組）。以六孔板的一個(gè)孔為例，首先取一無(wú)菌EP管加250μl OPTI-MEM培養(yǎng)基和5μl LipofectamineTM2000，輕輕混勻。在取另一無(wú)菌EP管加250μl OPTI-MEM培養(yǎng)基和2μg質(zhì)粒DNA，輕輕混勻。室溫下孵育5 min后，混勻以上兩種復(fù)合物，室溫孵育20 min。最后將此復(fù)合物加入到含有1.5ml OPTI-MEM的六孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)4～6 h后，換無(wú)血清ECM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24～48 h后，加入 G418（200μg／ml）進(jìn)行篩選，待未表達(dá)抗性基因的細(xì)胞被殺死后，將G418濃度改為100μg／ml維持一周。

1.3.4 Real time RT-PCR檢測(cè) HUVEC中 TRPC3 mRNA及STIM2mRNA的表達(dá) 引物由友名生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。STIM2的上游引物是5’-TCA GTA TGCAGA ACA GGA ATTGGA A-3′，下游引物是5’-GAA GTG CAT CTG GAA CAG ACC AAC-3’。TRPC3的上游引物是5’-CAT TCT CAA TCA GCC AAC ACG TTA T-3’，下游引物是 5’-CTC AGT TGC TTG GCTCTT GTC TTC-3’。用 Trizol法抽提細(xì)胞 RNA，分光光度法測(cè)定計(jì)算提取的總RNA含量及濃度。然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與real time RT-PCR試劑盒對(duì)mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄與多聚酶聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)體系為25 μl，其中 SYBR Premix Ex Tap 12.5μl，PCR Forward Primer 0.5μl，PCR Reverse Primer 0.5μl，樣品 cDNA 2.0μl，滅菌蒸餾水 9.5μl。反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃，30 s；PCR反應(yīng)（95℃ for 5 s、60℃ for 20 s），40個(gè)循環(huán)。

1.3.5 免疫印跡法檢測(cè)HUVEC中TRPC3、STIM2的蛋白表達(dá)及干擾效率 各轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染48 h后，用G418進(jìn)行穩(wěn)篩，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞3次，加入含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液（1∶100），提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑測(cè)定蛋白含量。SDS-PAGE電泳分離蛋白，選用硝酸纖維素膜（nitrocellulose，NC膜）進(jìn)行濕轉(zhuǎn)，用5%脫脂奶粉TBST溶液封閉 1 h，分別加入 TRPC3（1∶200）和 STIM2（1∶5 000）一抗，4℃冰箱中孵育。第二天 TBST洗膜四次，加入二抗（1∶5 000），37℃搖床上孵育 1 h。TBST洗膜3次。用ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，顯影、定影，獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.6 HUVEC中 Ca2＋濃度測(cè)定 參照文獻(xiàn)［5］將第2代或第3代HUVEC接種到圓形玻片上。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)給細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后將玻片取出放入自制的灌流槽中，將1μl濃度為1mmol／L的Fura-2／AM與499μl含2mmol／L含鈣液混合后加入灌流槽中，37℃孵育細(xì)胞30 min。沖洗3～5遍后用含鈣液去酯化30min。將灌流槽放于倒置熒光顯微鏡上，利用340 nm與380 nm波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)Ca2＋熒光探針Fura-2／AM發(fā)射熒光，用 CCD拍攝熒光的動(dòng)態(tài)變化，通過(guò)340 nm和380 nm的熒光強(qiáng)度比值的變化（即Δratio）反映［Ca2＋］i。

1.3.7 HUVEC中 NO含量的檢測(cè) 參照文獻(xiàn)［5］，將第2代或第3代HUVEC接種于放有圓形玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞達(dá)80%左右融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后將玻片取出放入自制的灌流槽中，按1∶2 000比例加入DAF-FM DA熒光探針稀釋液稀釋DAF-FM DA，37℃孵育細(xì)胞 20 min后，用 2 mmol／L含鈣液沖洗3次后將灌流槽放于熒光顯微鏡上，用495 nm激發(fā)波長(zhǎng)，515 nm發(fā)射波長(zhǎng)，實(shí)時(shí)檢測(cè)刺激前后熒光的強(qiáng)弱，并通過(guò) IPA Software進(jìn)行分析。NO含量＝（測(cè)定孔曲線最高相對(duì)熒光強(qiáng)度（relative fluorescence unit，RFU），-最低 RFU）-（空白孔曲線最高 RFU-最低 RFU）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光檢測(cè)HUVEC中STIM 2與TRPC3的蛋白表達(dá)

在共聚焦熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞，細(xì)胞核的DNA染料（DAPI）陽(yáng)性著色顯示為藍(lán)色熒光，TRPC3的陽(yáng)性著為綠色熒光，STIM2的陽(yáng)性著色為紅色熒光，可見(jiàn)HUVEC中STIM2和TRPC3蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性，且兩者均主要定位于胞漿（圖1見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅰ）。

2.2 激光共聚焦顯微鏡下觀察shRNA成功轉(zhuǎn)染HUVEC

細(xì)胞轉(zhuǎn)染Cy3標(biāo)記的shSTIM2后，激光共聚焦顯微鏡下觀察可見(jiàn)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞發(fā)出紅色熒光，可反映轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48 h后加入G418穩(wěn)篩后，可獲取90%以上的陽(yáng)性克隆細(xì)胞（圖2見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅰ）。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染FITC標(biāo)記的shTRPC3后，激光共聚焦顯微鏡下觀察可見(jiàn)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)發(fā)出綠色熒光，可反映轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48 h后加入G418穩(wěn)篩后，可獲取90%以上的陽(yáng)性克隆細(xì)胞（圖2見(jiàn)彩圖頁(yè) Ⅰ）。

2.3 Real time RT-PCR檢測(cè) HUVEC中 STIM 2 mRNA和TRPC3mRNA的表達(dá)及干擾效率

同一代HUVEC分為5組：即空白對(duì)照組（Control組）、空質(zhì)粒組（Vehicle組）和實(shí)驗(yàn)組（shSTIM2-001、shSTIM2-002、shSTIM2-003 組；shTRPC3-003、shTRPC3-004、shTRPC3-005組）。各轉(zhuǎn)染組分別轉(zhuǎn)染48 h后用G418進(jìn)行穩(wěn)篩后提取總mRNA，采用Real time RT-PCR檢測(cè)STIM2mRNA和TRPC3mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染各組與Control組相比，可見(jiàn)vehicle組mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05），其余各轉(zhuǎn)染組mRNA的表達(dá)均有降低，尤其是shSTIM2-002組中STIM2mRNA表達(dá)顯著降低（抑制率為88.2%（P＜0.05）、shTRPC3-004組中 TRPC3mRNA表達(dá)也是顯著降低（抑制率為 74%，P＜0.05，圖 3A，圖3B）。

Fig.3 Interference ratio ofmRNA after transfection in HUVEC（ˉx±s.n＝3）A：STTIM2 mRNA inhibition ratio（%）；B：TRPC3 mRNA inhibition ratio（%）*P＜0.05 vs control group；＃P＜0.05 vs vehicle group

2.4 免疫印跡技術(shù)檢測(cè)STIM 2和TRPC3的蛋白表達(dá)及干擾效率

提取轉(zhuǎn)染 48 h、用 G418（200mg／L）進(jìn)行篩選 7 d后HUVEC總蛋白，轉(zhuǎn)染各組與Control組相比，可見(jiàn)vehicle組的蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05），其余各轉(zhuǎn)染組蛋白的表達(dá)均有降低，尤其是shSTIM2-002組中STIM2的蛋白表達(dá)顯著降低（抑制率為79.9%（P＜0.05）、shTRPC3-004組中 TRPC3的蛋白表達(dá)也是顯著降低（抑制率為 71.7%，P＜0.05，圖 4）。

Fig.4 Expression of the protein examined by Western blot and their inhibition ratio in HUVEC（ˉx±sˉx，n＝3）A：The expression of the STIM2 protein and its inhibition ratio；B：The expression of the TRPC3 protein and its inhibition ratio*P＜0.05 vs control group；＃P＜0.05 vs vehicle group

2.5 在精胺刺激下各轉(zhuǎn)染組HUVEC內(nèi)［Ca2＋］i和NO生成的變化

選取干擾效率最高的ShSTIM2-002和ShTRPC3-004組為實(shí)驗(yàn)組（即精胺＋Ca2＋＋ShSTIM2-002組和精胺＋Ca2＋＋ShTRPC3-004組），其余兩組分別為空白對(duì)照組（Control組，即精胺 ＋Ca2＋組），空質(zhì)粒組（Vehicle組，即精胺 ＋Ca2＋＋Vehicle組），將四組細(xì)胞接種于圓形玻片上，待HUVEC生長(zhǎng)融合至80%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后將玻片取出放入灌流槽中測(cè)定［Ca2＋］i△ratio值和NO熒光強(qiáng)度值的變化，與精胺＋Ca2＋及精胺＋Ca2＋＋Vehicle組相比，精胺 ＋Ca2＋＋ShSTIM2-002組及精胺 ＋Ca2＋＋ShTRPC3-004組 ［Ca2＋］i△ratio值和 NO凈熒光強(qiáng)度值均無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明 ShRNA沉默STIM2或TRPC3基因，未能使CaR介導(dǎo)的［Ca2＋］i和NO生成減少（圖 5、6）。

Fig.5 Dynamic changes of intracellular calcium fluorescence intensity ratio after CaR agonist spermine in different transfected HUVEC

Fig.6 Dynamic changes of NO fluorescence intensity after CaR agonist spermine in different transfected HUVEC

Tab.1 Intracellular calcium fluorescence intensity ratio and dynamic changes of net NO fluorescence intensity after CaR agonist spermine in different transfected HUVEC（ˉx±ˉsx，n＝3）

3 討論

作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，Ca2＋在信息的傳遞，生命過(guò)程的調(diào)控中起著非常重要的作用［5］。研究證實(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)的外Ca2＋內(nèi)流是NO釋放的必須條件，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究也表明細(xì)胞外Ca2＋可調(diào)節(jié)NO生成?？梢?jiàn)，在NO生成過(guò)程中［Ca2＋］i變化起著舉足輕重的作用。CaR屬于GPCRC家族的II型受體，CaR可通過(guò)介導(dǎo)內(nèi)Ca2＋釋放和Ca2＋內(nèi)流調(diào)控［Ca2＋］i，當(dāng)CaR被激活，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的三磷酸肌醇（inositol 1，4，5-trisphosphate，IP3）受體途徑可引起Ca2＋庫(kù)耗竭（即內(nèi) Ca2＋釋放），使 SOC激活，引發(fā)外Ca2＋內(nèi)流使［Ca2＋］i升高［6］。以往研究大多只關(guān)注細(xì)胞內(nèi)鈣釋放對(duì)［Ca2＋］i及 NO生成的影響［7］，而細(xì)胞內(nèi)鈣池持續(xù)釋放有賴于外Ca2＋內(nèi)流對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣池的重新填充［8］，且本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在HUVEC中CaR激活引發(fā)持續(xù)Ca2＋內(nèi)流是NO生成重要條件［3-4］，但參與Ca2＋內(nèi)流關(guān)鍵分子組件尚不清楚。

STIM作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）上的Ca2＋感受器，存在有2個(gè)亞型：STIM1和 STIM2，表達(dá)在不同類(lèi)型的細(xì)胞中。在豬的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)STIM1在凝血酶經(jīng)蛋白水解酶-激活受體-1介導(dǎo)SOC及依賴SOC的NO生成過(guò)程中起著重要作用［9］，在人的成肌細(xì)胞分化及肌管興奮-收縮偶聯(lián)過(guò)程中STIM2是STIM1必須的伴侶蛋白，STIM1通過(guò)與STIM2相互作用介導(dǎo) SOC活化［10］。與 STIM1要在ER內(nèi)Ca2＋幾乎完全耗竭才被激活不同，STIM2可以感受ER中Ca2＋濃度較小程度的變化，當(dāng)Ca2＋庫(kù)部分排空而STIM1未被激活時(shí)，STIM2被激活從而維持SOC的開(kāi)放［11］。TRPCs包括7個(gè)亞型。其中TRPC1可與C1或TRPC亞家族中其它亞基以同源二聚體或異源二聚體及多聚體形式構(gòu)成不同的SOC，發(fā)揮不同的生理和病理生理作用。TRPC3作為其中的一種亞型，可參與多種疾病病理生理過(guò)程。Reading等［12］研究發(fā)現(xiàn)抑制TRPC3的表達(dá)可減少細(xì)胞去極化作用，該作用主要是通過(guò)抑制三磷酸尿苷（uridine triphosphate，UTP）激活的陽(yáng)離子內(nèi)流，從而抑制了UTP所介導(dǎo)的血管平滑肌收縮，因此，TRPC3有促進(jìn)陽(yáng)離子流通和促收縮作用。

本課題組前期的研究顯示，在HUVEC中有CaR的表達(dá)，并通過(guò)使用CaR激動(dòng)劑Spermine和負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑Calhex231及CaR干擾技術(shù)，證實(shí)了在HUVEC中CaR激活后經(jīng) SOC參與了 ［Ca2＋］i升高及NO生成［3，4，13］，但 STIM2及 TRPC3是否為 CaR介導(dǎo)Ca2＋和NO生成的分子組件目前還有待研究。作為一種高效、快速、特異的基因阻斷技術(shù)，RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)近年來(lái)被廣泛使用，它能通過(guò)正、反義 RNA片段形成雙鏈 RNA，由雙鏈RNA特異性地引起同源靶基因mRNA降解，使其基因表達(dá)受到抑制［14］。那么在 HUVEC中分別沉默STIM2及 TRPC3基因，CaR介導(dǎo)的［Ca2＋］i和 NO的生成會(huì)有什么變化呢？本研究首先用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)STIM2和TRPC3兩者在HUVEC中均有表達(dá)。然后采用脂質(zhì)體法將設(shè)計(jì)好的shRNA包裹轉(zhuǎn)染到HUVEC中，并使用Cy3和FITC標(biāo)記的shRNA，轉(zhuǎn)染48 h后用G418進(jìn)行穩(wěn)篩后，在熒光顯微鏡下可以看到80%的細(xì)胞都發(fā)出綠色或紅色熒光。對(duì)轉(zhuǎn)染后STIM2和TRPC3的蛋白和mRNA表達(dá)定量分析結(jié)果表明沉默STIM2和TRPC3基因可有效抑制 STIM2和 TRPC3的蛋白和 mRNA表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，本研究以激動(dòng)劑Spermine作為配體激活CaR，在細(xì)胞外有鈣的情況下，STIM2和TRPC3基因沉默組HUVEC中［Ca2＋］i與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯的變化。已知Ca2＋是激活eNOS生成NO的重要輔助因子，那么沉默STIM2和TRPC3基因是否會(huì)對(duì)NO生成產(chǎn)生影響呢？進(jìn)一步的結(jié)果顯示，無(wú)論是沉默STIM2基因還是沉默TRPC3基因都未影響NO的生成。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RNAi沉默 HUVEC中STIM2和 TRPC3的表達(dá)，成功構(gòu)建了 shSTIM2和shTRPC3，為后續(xù)相關(guān)STIM2和TRPC3基因功能的研究打下了基礎(chǔ)，并進(jìn)一步證實(shí)了STIM2和TRPC3并非CaR介導(dǎo)的鈣內(nèi)流和NO生成的關(guān)鍵組件。目前尚未有關(guān)于STIMs和TRPCs在其他組織細(xì)胞中介導(dǎo)鈣活動(dòng)及其相關(guān)功能的報(bào)道，深入研究STIMs和TRPCs的功能，除了會(huì)對(duì)深入了解血管生理和病理生理產(chǎn)生重要意義，更會(huì)為今后進(jìn)一步從調(diào)節(jié)［Ca2＋］i相關(guān)蛋白角度探討心血管疾病的發(fā)病機(jī)制和防治措施提供新的思路和靶點(diǎn)。

衷心感謝華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系／衛(wèi)生部呼吸疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)指導(dǎo)。

［1］ Zheng L，Stathopulos PB，LiGY，etal.Biophysical characterization of the EF-hand and SAM domain containing Ca2＋sensory region of STIM1 and STIM2［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，369（1）：240-246.

［2］ Groschner K，Hingel S，Lintschinger B，et al.Trp proteins form store-operated cation channels in human vascular endothelial cells［J］.FEBSLett，1998，437（1-2）：101-106.

［3］ 王振煥，胡清華，鐘 華，等.小凹蛋白-1在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞CaR介導(dǎo)NO生成 中的作用和機(jī)制［J］.中國(guó)病理生理雜志，2011，27（5）：934-938.

［4］ 王振煥，胡清華，鐘 華，等.小凹蛋白-1下調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞外鈣敏感受體介導(dǎo)的鈣內(nèi)流［J］.生理學(xué)報(bào)，2011，63（1）：39-47.

［5］ ZhangW，Xu C.Calcium sensing receptor and heartdiseases［J］.Pathophysiology，2009，16（4）：317-323.

［6］ 王桂君，姚玉勝，李戇鵬，等.Ca2＋信號(hào)在腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)心肌肥大 PI3-K信號(hào)途徑中的作用［J］.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2010，28（3）：284-288.

［7］ Ziegelstein RC，Xiong Y，He C，et al.Expression of a functional extracellular calcium-sensing receptor in human aortic endothelial cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，342（1）：153-163.

［8］ 吳 揚(yáng)，耿 鵬，王玉琴，等.MicroRNA-1在心肌肥大中對(duì)L-型鈣通道β2亞基的負(fù)性調(diào)控作用［J］.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2012，28（4）：304-308.

［9］ Chow JY，Estrema C，Orneles T，etal.Calcium-sensing receptormodulates extracellular Ca2＋entry via TRPC-encoded receptor-operated channels in human aortic smooth muscle cells［J］.Am JPhysiol Cell Physiol，2011，301（2）：C461-468.

［10］Liao Y，Erxleben C，Abramowitz J，etal.Functional interactions among Orai1，TRPCs，and STIM1 suggest a STIM-regulated heteromeric Orai／TRPC model for SOCE／Icrac channels［J］.PNAS，2008，105（8）：2895-2900.

［11］Brandman O，Liou J，Park WS，etal.STIM2 is a feedback regulator that stabilizes basal cytosolic and endoplasmic reticulum Ca2＋levels［J］.Cell，2007，131（7）：1327-1339.

［12］Reading SA，Earley S，Waldron BJ，etal.TRPC3mediates pyrimidine receptor-induced depolarization of cerebral arteries［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，288（5）：H2055-2061.

［13］梁 霄，羅小林，鐘 華，等.小干擾RNA沉默細(xì)胞外鈣敏感受體抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞鈣內(nèi)流和NO生成［J］.生理學(xué)報(bào)，2012，64（3）：289 295.

［14］Ashihara E，Kawata E，Maekawa T.Future prospectof RNA interference for cancer therapies［J］.Curr Drug Targets，2010，11（3）：345-360.