糖基化終產(chǎn)物對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激及MCP-1表達(dá)的影響及機(jī)制*

馮 敏，徐成波，溫俊平，林桂芳，呂 琦，黃國(guó)良

（1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬教學(xué)醫(yī)院福建省老年醫(yī)院內(nèi)分泌科，福州350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院血液科，福州350004；3.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科，福州350001）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是以腎小球硬化，小管間質(zhì)纖維化為病理特征的糖尿病慢性并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制尚無定論。長(zhǎng)期高血糖刺激下引起的蛋白質(zhì)非酶糖基化，導(dǎo)致糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycosylation end products，AGEs）形成與堆積是DN的可能發(fā)病機(jī)制之一。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，AGEs可以通過其受體（receptor for AGEs，RAGE）結(jié)合，誘導(dǎo)腎臟纖維化因子的表達(dá)，促進(jìn)DN腎臟纖維化。國(guó)外研究表明，DN作為一種炎癥性腎病，在其發(fā)生體系中，氧化應(yīng)激和RAGE存在相互作用的關(guān)系，可以擴(kuò)大細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)，加速組織器官功能損壞，加速病程的進(jìn)展。然而AGEs促進(jìn)這些損傷因子合成增加的具體機(jī)制尚不清楚。

本研究擬通過觀察AGEs通過其受體RAGE對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞中氧化應(yīng)激（oxidative stress）及單核細(xì)胞趨化因子-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）水平的影響，以期闡明三者之間的相互作用，為尋找DN新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（美國(guó)Amresco公司）；無血清低糖DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；D-葡萄糖（分析純，重慶北培化學(xué)試劑廠）；焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）和 Trizol試劑（上海生物工程公司）；人IgG、兔抗人RAGE多克隆中和性抗體（北京博奧森生物公司）；兔抗人RAGE單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗（北京中杉金橋生物公司）；MCP-1，GAPDH引物（上海 Invitrogen公司）；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒（北京碧云天生物科技公司）；免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物公司）

1.2 主要儀器

37℃飽和濕度5%CO2培養(yǎng)箱（中國(guó)力康公司）；凝膠成像分析掃描儀（美國(guó)BIO-Rad公司）；FACScan型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton Dickinson公司）；PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI公司）；核酸蛋白定量?jī)x（美國(guó)Thermo公司）；紫外分光光度儀（日本Shimadzu公司）；水平式核酸電泳儀（北京六一儀器廠）；低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）。

1.3 人腎小球系膜細(xì)胞的培養(yǎng)

人腎小球系膜細(xì)胞系（huamn renal mesangial cells，HRMCs）購(gòu)自中國(guó)培養(yǎng)物保藏中心。用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按1×105移入6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合狀態(tài)時(shí)，用無血清的低糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化后用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 AGE-BSA的制備

BSA濃度為 5.0 g／L，葡萄糖濃度為 50 mmol／L，充分溶解于pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中，過濾除菌，37℃下無菌避光孵育3個(gè)月。用磷酸鹽緩沖溶液透析除去未結(jié)合的葡萄糖。同樣條件制備不含葡萄糖的BSA，作為陰性對(duì)照。熒光分光光度計(jì)（激發(fā)波長(zhǎng)370 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm，狹縫3 nm）鑒定AGEs。

1.5 細(xì)胞干預(yù)及實(shí)驗(yàn)分組

分別用不同濃度的 AGE-BSA（50、100、200及400mg／L）干預(yù)培養(yǎng)，以不含葡萄糖的相應(yīng)質(zhì)量濃度的BSA為陰性對(duì)照，不含任何刺激物的低糖DMEM培養(yǎng)液為空白對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔，48 h后收集細(xì)胞。選取敏感濃度200 mg／L的AGE-BSA和相同質(zhì)量濃度的 BSA分別培養(yǎng)（12、24、48及 72 h），每組 3個(gè)復(fù)孔，于不同干預(yù)時(shí)間收集細(xì)胞?？筊AGE抗體阻斷實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞分為5組：（1）不含任何刺激物的低糖 DMEM空白對(duì)照組；（2）BSA 200 mg／L組；（3）AGE-BSA 200mg／L組；（4）AGE-BSA 200mg／L＋人 IgG 50mg／L組；（5）AGE-BSA 200 mg／L＋兔抗人RAGE多克隆中和性抗體 50 mg／L組。每組3個(gè)復(fù)孔，48 h后收集細(xì)胞。

1.6 細(xì)胞免疫化學(xué)方法檢測(cè)RAGE的蛋白表達(dá)水平

將貼壁于載玻片上的HRMCs用非免疫血清封閉后，用1∶200兔抗人RAGE抗體4℃孵育過夜后再和二抗孵育30min，加入顯色劑后蘇木素復(fù)染，95%乙醇脫水后封片，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件分析光密度值，得出RAGE蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 ROS捕獲及流式細(xì)胞儀檢測(cè)

用氧化敏感探針二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯（2’，7’-Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）作為ROS捕獲劑，以5μmol／L的DCFH-DA孵育實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞30min，同時(shí)另設(shè)空白對(duì)照（不加DCFH-DA），在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)ROS水平，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。每個(gè)樣品測(cè)定105個(gè)活細(xì)胞，檢測(cè)二氯熒光黃（dichlorofluorescin，DCF）的平均熒光強(qiáng)度。

1.8 RT-PCR法檢測(cè)MCP-1的mRNA表達(dá)水平

Trizol試劑一步法提取細(xì)胞總RNA，并鑒定RNA的完整性。取2μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參照，上游引物5’-CAA GGTCATCCATGACAACTTTG-3’，下游引物 5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為497 bp；單核細(xì)胞趨化因子-1（MCP-1）上游引物 5’-2 TGTCTGGACCCATTCCTTCT-3’，下 游 引 物 5’-ACCAGCAAGATGATCCCAAT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為140 bp，擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性 2 min，94℃變性 30 s，56℃退火30 s，72℃延伸 1 min（共 25個(gè)循環(huán)）。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，圖像分析儀上分析目的條帶與內(nèi)參照條帶的光密度比值進(jìn)行半定量分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行資料分析，多組間比較采用單因素方差分析析（one-way ANOVA）。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度AGE-BSA對(duì)HRMCs細(xì)胞RAGE蛋白表達(dá)水平的影響

細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)顯示，正常人HRMCs細(xì)胞中存在RAGE的微量表達(dá)，BSA組RAGE蛋白表達(dá)與空白對(duì)照組無明顯差異，而加入不同濃度（100、200、400mg／L）的 AGE-BSA作用 48 h后，RAGE蛋白水平隨AGE-BSA濃度的增高而表達(dá)增強(qiáng)，與空白對(duì)照組和BSA組比較有顯著差異（P＜0.05，圖1）。

Fig.1 Expression of RAGE in HRMCs after treatmentwith different concentrations of AGE-BSA for 48 h（ˉx±s，n＝3）1：Blank group；2：BSA group（200 mg／L）；3：AGE-BSA group（100 mg／L）；4：AGE-BSA group（200 mg／L）；5：AGE-BSA group（400mg／L）；RAGE：Receptor for advanced glycosylation end product；HRMCs：Human renal mesangial cells；AGE-BSA：Advanced glycosylation end product-bovine serum albumin*P＜0.05 vs BSA group；＃P＜0.05 vs blank group

2.2 不同濃度 AGE-BSA對(duì) HRMCs細(xì)胞 ROS水平及MCP-1mRNA表達(dá)的影響

不同濃度AGE-BSA作用HRMCs細(xì)胞48 h后，AGE-BSA各組ROS產(chǎn)生量與空白組和相應(yīng)濃度BSA組比較明顯升高（P＜0.05），并呈濃度依賴性上升，而BSA干預(yù)細(xì)胞后，ROS水平與空白組比較無顯著差異（表1）。

RT-PCR結(jié)果顯示，正常HRMCs細(xì)胞表達(dá)少量的 MCP-1。加入不同濃度（50、100、200、400 mg／L）的AGE-BSA作用48 h后，MCP-1 mRNA水平與相應(yīng)濃度的BSA組和空白對(duì)照組比較均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著AGE-BSA濃度的增加而表達(dá)增高，而相應(yīng)BSA組MCP-1水平與空白組比較均無顯著差異（圖2）。

Tab.1 Product of ROS and MCP-1 in the HRMCs after treatment with different concentrations of AGE-BSA or BSA for48 h（ˉx±s，n＝3）

Fig.2 Expression ofMCP-1 in HRMCs after treatmentwith different concentrations of AGE-BSA or BSA for 48 h（n＝3）Marker：DNAmarker（DL2000）；1：Blank；2：BSA（50mg／L）；3：AGE-BSA（50 mg／L）；4：BSA（100 mg／L）；5：AGE-BSA（100 mg／L）；6：BSA（200 mg／L）；7：AGE-BSA（200mg／L）；8：BSA（400 mg／L）；9：AGE-BSA（400 mg／L）；MCP-1：Monocyte chemoattractant protein-1；HRMCs：Human renalmesangial cells；AGE-BSA：Advanced glycosylation end product-bovine serum albumin

2.3 AGE-BSA作用HRMCs不同時(shí)間后ROS水平及MCP-1mRNA表達(dá)的影響

200mg／L的AGE-BSA作用不同時(shí)間后，各作用時(shí)間點(diǎn)ROS產(chǎn)生量與空白對(duì)照組和BSA組比較明顯升高（P＜0.05），呈時(shí)間依賴性上升，而不同作用時(shí)間的BSA干預(yù)細(xì)胞后，ROS水平與空白組比較無顯著差異（表2）。

Tab.2 Product of ROSand MCP-1 in the HRMCs after treatment with 200 mg／L AGE-BSA or BSA detected at different time points（ˉx±s，n＝3）

RT-PCR結(jié)果顯示，加入敏感濃度200 mg／L的AGE-BSA作用不同時(shí)間（12、24、48、72h）后 MCP-1 mRNA的表達(dá)水平與200mg／LBSA相應(yīng)作用時(shí)間組和空白對(duì)照組比較均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而表達(dá)增加，而不同時(shí)間BSA組與空白組比較均無顯著差異（P＞0.05，圖 3）。

Fig.3 Expression ofMCP-1 in HRMCs after treatmentwith AGEBSA（200 mg／L）or BSA（200 mg／L）detected at different time points（ˉx±s，n＝3）Maker：DNAmarker（DL2000）；1：Blank；2：BSA（12 h）；3：AGE-BSA（12 h）；4：BSA（24 h）；5：AGE-BSA（24 h）；6：BSA（48 h）；7：AGE-BSA（48 h）；8：BSA（72 h）；9：AGE-BSA（72 h）；MCP-1：Monocyte chemoattractant protein-1；HRMCs：Human renal mesangial cells；AGE-BSA：Advanced glycosylation end product-bovine serum albumin

2.4 抗RAGE中和性抗體對(duì)AGE-BSA誘導(dǎo)HRMCs細(xì)胞內(nèi)ROS水平及MCP-1mRNA表達(dá)的影響

ROS表達(dá)水平在空白組與BSA組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；200 mg／L的 AGE-BSA作用 48 h后，與空白組和BSA組比較ROS水平明顯增加（P＜0.05）；AGE-BSA＋抗RAGE抗體組明顯抑制AGEBSA誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，與AGE-BSA組比較，兩組之間有顯著差異（P＜0.05），而 AGE-BSA＋I(xiàn)gG組與AGE-BSA組比較無顯著差異（P＞0.05，表 3）。

Tab.3 Product of ROSand MCP-1 in the HRMCs after treatment with AGE-BSA or neutralizing antibodies to RAGE（ˉx±s，n＝3）

RT-PCR結(jié)果顯示，MCP-1的表達(dá)在空白組與BSA組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AGE-BSA組MCP-1的表達(dá)水平與空白組和BSA組比較均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；AGE-BSA＋抗 RAGE抗體組明顯抑制AGE-BSA誘導(dǎo)MCP-1的表達(dá)，與AGEBSA組比較，兩組之間有顯著差異（P＜0.05），而AGE-BSA＋I(xiàn)gG組則沒有這種作用（圖4）。

Fig.4 Expression of MCP-1 in the HRMCs after treatment with AGE-BSA or neutralizing antibodies to RAGE（n＝3）1：Blank；2：BSA（200 mg／L）；3：AGE-BSA（200 mg／L）；4：AGE-BSA（200 mg／L＋I(xiàn)gG（50 mg／L）；5：AGE-BSA（200 mg／L）＋ RAGE antibody（50 mg／L）；MCP-1：Monocyte chemoattractant protein-1；HRMCs：Human renalmesangial cells；AGE-BSA：Advanced glycosylation end productbovine serum albumin；RAGE：Receptor for advanced glycosylation end products

3 討 論

AGEs是由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸等大分子物質(zhì)在沒有酶的催化下，自發(fā)地與葡萄糖或其他還原單糖反應(yīng)生成的穩(wěn)定共價(jià)化合物。它廣泛存在人體血液及各種組織中，正常人體內(nèi)AGEs水平隨年齡增長(zhǎng)可緩慢增加，但是在糖尿病狀態(tài)下，持續(xù)的高糖刺激，AGEs生成增加，并與其受體RAGE結(jié)合，激發(fā)多條信號(hào)途徑，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種纖維化因子及炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生。

近年來，DN被認(rèn)為是一種自然免疫和低度炎癥性疾病的觀點(diǎn)日益受到關(guān)注。其中心環(huán)節(jié)可能是通過氧化應(yīng)激，產(chǎn)生ROS，激活多條信號(hào)通路，干擾細(xì)胞胰島素信號(hào)傳導(dǎo)；同時(shí)又促進(jìn)炎癥因子的合成與分泌，形成惡性循環(huán)。其中MCP-1介導(dǎo)的單核細(xì)胞／巨噬細(xì)胞在腎臟的聚集和活化所引起的炎癥反應(yīng)是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一，MCP-1過度表達(dá)會(huì)介導(dǎo)大量單核巨噬細(xì)胞趨化、激活，促進(jìn)多種活性物質(zhì)釋放，以及蛋白水解酶導(dǎo)致腎小球結(jié)構(gòu)損傷。

氧化應(yīng)激是ROS生成增多或抗氧化劑清除防御作用減弱從而引起體內(nèi)氧化與抗氧化的作用失衡，造成了體內(nèi)大量活性氧自由基的積聚，導(dǎo)致活性氧連鎖反應(yīng)，從而促進(jìn)糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展［1］。在AGEs的生成過程中可伴有葡萄糖和酮胺化合物（Amadori產(chǎn)物）的自氧化而產(chǎn)生ROS，而ROS的產(chǎn)生也能促進(jìn)AGEs的生成。ROS作為一種促炎癥刺激的信號(hào)分子，介導(dǎo)包括RAGE在內(nèi)的多種細(xì)胞膜表面受體的信號(hào)傳導(dǎo)通路［2］。同時(shí)NADPH氧化酶作為細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要來源，是氧化應(yīng)激的基本環(huán)節(jié)［3］。AGEs與 RAGE結(jié)合后直接激活NADPH氧化酶，ROS的生成便迅速增加，并進(jìn)一步激活促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1／2（extracellular signal-regulated kinase，ERK1／2）和 P38等介導(dǎo)的信號(hào)通路，使核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）發(fā)生磷酸化而活化，促進(jìn)腎臟細(xì)胞多種炎癥因子、趨化因子及黏附因子的釋放如MCP-1、白細(xì)胞介素-1、細(xì)胞黏附因子-1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、血小板源性生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子-α等，這些因子構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，以自分泌和旁分泌的方式作用于腎臟細(xì)胞，使腎小球發(fā)生典型的病理改變。

研究表明，在慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）中，尤其是炎癥性腎臟病中MCP-1的表達(dá)可顯著升高［4］。DN病人尿中MCP-1的水平和蛋白尿的水平明顯呈正相關(guān)［5］，同時(shí)實(shí)驗(yàn)研究證明在特定條件的刺激下，三種腎小球固有細(xì)胞均可以表達(dá)MCP-1［6］，體外實(shí)驗(yàn)顯示高糖以及糖化血紅蛋白可以直接誘導(dǎo)系膜細(xì)胞產(chǎn)生 MCP-1［7，8］。

RAGE是目前研究最明確的AGEs特異性結(jié)合受體，廣泛存在于多種細(xì)胞表面，如腎小球系膜細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等。RAGE在正常情況下表達(dá)很低，但在病理?xiàng)l件下如糖尿病、炎癥、機(jī)械血管損傷時(shí)則可表達(dá)增加，且與配體之間存在正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，在炎癥因子參與的病理生理網(wǎng)絡(luò)中可能發(fā)揮著重要的介導(dǎo)作用，是炎癥因子導(dǎo)致機(jī)體損傷的共同作用通道。

抗RAGE抗體和可溶性RAGE是公認(rèn)的RAGE阻斷劑?？扇苄訰AGE是RAGE的細(xì)胞外段部分，它可特異結(jié)合AGEs，但由于不具有胞內(nèi)段部分，所以不介導(dǎo)生物效應(yīng)。抗RAGE抗體則是通過封閉細(xì)胞膜上的RAGE使其不能與AGEs結(jié)合發(fā)揮生物效應(yīng)。研究表明用抗RAGE抗體封閉RAGE可以減少AGEs-RAGE介導(dǎo)的氧化應(yīng)激及炎癥因子、纖維化因子的表達(dá)［9］。我們前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AGEs可以引起腎臟纖維化因子如結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）、纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）的表達(dá)增加，給予抗RAGE抗體進(jìn)行干預(yù)后，可以完全阻斷AGEs的誘導(dǎo)作用，無關(guān)抗體則不能阻斷AGEs使 CTGF、FN表達(dá)升高的效應(yīng)，提示 AGEs誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞中纖維化因子的表達(dá)是由RAGE介導(dǎo)的。其機(jī)制可能是，AGEs與RAGE結(jié)合通過TGF-β依賴性途徑誘導(dǎo)CTGF表達(dá)增加，并通過蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）通路增加 FN的表達(dá)［10］。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在AGE-BSA刺激下，RAGE蛋白水平隨AGE-BSA濃度的增高而表達(dá)上調(diào)，并明顯促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞中ROS的水平，呈時(shí)間和劑量依賴性。與此同時(shí)，隨著濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，MCP-1表達(dá)也逐漸增強(qiáng)，通過中和抗RAGE抗體封閉細(xì)胞膜上RAGE，阻止AGEs與受體結(jié)合，則可抑制這些作用，表明 AGEs的這一生物學(xué)作用是由RAGE介導(dǎo)。AGEs以RAGE依賴方式誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)ROS快速地產(chǎn)生，并直接誘導(dǎo)系膜細(xì)胞表達(dá)MCP-1，且這種作用可以被抗RAGE抗體所抑制，證明ROS作為一種信號(hào)分子，可以直接誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)MCP-1。因此ROS在AGEs誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中具有中心地位。

總之，本研究證實(shí)AGEs與細(xì)胞表面受體RAGE相互作用可激活氧化應(yīng)激并誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞中MCP-1的表達(dá)增強(qiáng)，是糖尿病炎癥損傷過程中的重要環(huán)節(jié)。在糖尿病及其慢性并發(fā)癥的發(fā)生機(jī)制和防治研究中，RAGE可能作為一個(gè)有潛力的干預(yù)靶點(diǎn)，通過抑制氧化應(yīng)激或阻斷AGEs-RAGE的相互作用，從而減少ACES的生成，為糖尿病及其并發(fā)癥防治提供新思路、新方法。

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