心房肌胞內(nèi)鈣濃度變化對(duì)心房顫動(dòng)患者小電導(dǎo)鈣激活鉀通道電流的影響*

王 華，李 濤，張 麗，李妙齡，楊 艷，曾曉榮

心房顫動(dòng)（atrial fibrillation，AF）的臨床發(fā)病率逐年增加，嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康。目前對(duì)AF的主要治療方法有藥物治療、介入治療、手術(shù)治療，但治療效果并不理想，這與AF機(jī)制不明有關(guān)。AF發(fā)生機(jī)制包括：“折返”學(xué)說(shuō)、“驅(qū)動(dòng)伴顫動(dòng)樣傳導(dǎo)”學(xué)說(shuō)、“肺靜脈波”學(xué)說(shuō)和“房顫致房顫”理論。

AF的發(fā)生與動(dòng)作電位的時(shí)程和形態(tài)密切相關(guān)，而動(dòng)作電位時(shí)程和形態(tài)則由心肌細(xì)胞上不同的離子通道活動(dòng)決定。小電導(dǎo)鈣激活鉀通道（small conductance Ca2＋-activated K＋channels，SK）是鈣激活鉀通道中的一種，具有鉀離子選擇性、鈣敏感性、電壓不依賴(lài)的特性。SK2通道是SK通道的一種亞型，分布在多種組織和器官，如腦組織、平滑肌、骨骼肌和心肌，在哺乳動(dòng)物心房中的表達(dá)比心室更為豐富［1］。在SK2通道的特異性阻斷劑apamin作用下，心房肌細(xì)胞動(dòng)作電位的終末期形態(tài)發(fā)生改變，動(dòng)作電位時(shí)程明顯延長(zhǎng)，表明SK2通道在心臟動(dòng)作電位的復(fù)極末期發(fā)揮著重要作用［2］。因此，SK2通道在AF發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。本文以人心房肌細(xì)胞為研究對(duì)象，采用β-escin與二性霉素B作為穿孔液的穿孔膜片鉗技術(shù)，通過(guò)改變電極液內(nèi)的鈣離子濃度，研究SK2通道的鈣依賴(lài)特性，以及在不同的胞內(nèi)游離鈣離子濃度時(shí)AF患者與竇性心律（sinus rhythm，SR）患者SK2通道鈣依賴(lài)的差異，闡明SK2通道鈣敏感性的改變?cè)贏F發(fā)生和維持中的病理生理學(xué)意義，為防治心房顫動(dòng)提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 溶液與試劑

V型膠原酶、XXIV型蛋白酶、牛血清白蛋白、apamin、二性霉素 B、β-escin、DMSO均為 Sigma公司生產(chǎn)，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 患者資料

實(shí)驗(yàn)采用瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心胸外科行體外循環(huán)術(shù)的患者常規(guī)切除的右心耳組織作研究對(duì)象，獲取標(biāo)本是通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)和病人家屬同意。根據(jù)患者心電圖結(jié)果對(duì)其分組：SR組21例（細(xì)胞 n＝31），AF組 8例（細(xì)胞 n＝11）。

1.3 急性酶分離人心房肌細(xì)胞

收集的新鮮標(biāo)本采用改良的兩步急性酶分離方法獲得人心房肌細(xì)胞［3］。將分離的細(xì)胞置于KB液中4℃保持，待細(xì)胞貼壁后即可進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)。

1.4 通道電流的記錄

本研究采用的是穿孔膜片鉗的記錄方式，分別配置 30mg／ml的二性霉素 B和 27.2μg／ml的β-escin的母液。實(shí)驗(yàn)前用電極液將β-escin和二性霉素B稀釋成6.88μg／ml、150μg／ml的終濃度，混合的穿孔電極液置于4℃冰箱備用。本電極液DMSO在浴液中的終濃度為0.2%，預(yù)試實(shí)驗(yàn)證實(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)明顯影響［4］。

全 細(xì) 胞 浴 液 （mmol／L）：N-methyl-glucamine（NMG）140，KCl4，MgCl21，Glucose5和 HEPES10，用HCl調(diào)至 pH 7.4。全細(xì)胞電極內(nèi)液（mmol／L）：Potassium gluconate 144，MgCl21.15，EGTA 5，HEPES 10，用KOH調(diào)至pH 7.25，電極液游離鈣濃度用WINMAXC V2.50軟件進(jìn)行計(jì)算。經(jīng)計(jì)算可得，當(dāng)電極液中EGTA濃度是 5 mmol／L，電極液中鈣濃度分別為0.86，0.92mmol／L時(shí)，游離鈣離子濃度分別為 5×10-7，10-6mol／L。

將細(xì)胞懸液置于浴槽中，加入全細(xì)胞浴液待細(xì)胞貼壁后即可進(jìn)行電生理實(shí)驗(yàn)，倒置相差顯微鏡下尋找貼壁、立體感強(qiáng)、橫紋清晰、細(xì)胞膜完整、長(zhǎng)梭形、無(wú)收縮的心肌細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)。電流刺激方案：保持電位-55 mV，＋10 mV一個(gè)階躍，從-130 mV去極化到＋50mV，脈沖持續(xù)時(shí)間200ms，在電壓鉗的模式下記錄電流。浴液中加入SK2電流的特異性阻斷劑apamin，將加藥前后分別記錄的具有內(nèi)向整流特性的電流相減即為apamin敏感的SK2通道電流。Apamin對(duì)SK2電流最敏感，因此低濃度的apamin只能抑制SK2電流，對(duì)SK1和SK3電流不影響。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示。膜片鉗實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Clampex 10.1軟件系統(tǒng)采集后儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)中，經(jīng)分析程序Clampfit 10.1計(jì)算出電流密度（pA／pF），用 OriginPro 8.0進(jìn)行分析作圖。膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Originpro 8.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，細(xì)胞加藥前后采用自身配對(duì) t檢驗(yàn)，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或獨(dú)立樣本方差分析。

2 結(jié)果

2.1 SR組SK2通道電流的內(nèi)向整流性及apam in敏感性

當(dāng)電極內(nèi)液的游離鈣濃度為5×10-7mol／L時(shí)，給予刺激方案后，在人心房肌細(xì)胞上可以記錄到一個(gè)內(nèi)向整流混合電流，I-V曲線(xiàn)可觀(guān)察到隨細(xì)胞膜電位逐漸增加，電流逐漸偏離歐姆定律的線(xiàn)性關(guān)系。在浴液中加入10-7mol／L apamin后，內(nèi)向整流混合電流逐漸減小，將加藥前后分別記錄的具有內(nèi)向整流特性的電流相減即為apamin敏感的SK2通道電流（圖 1）。

Fig.1 SK2 currents A：Inwardly rectifying and apamin-sensitive properties of SK2 currentswere recorded in SR group；B：Integrated inward currents recorded before and after application of apamin are depicted；SK2：Small conductance Ca2＋-activated-K＋ channels；SR：Sinus ryhthm

2.2 AF組SK2通道電流的內(nèi)向整流性及apam in敏感性

在AF組患者心房肌細(xì)胞給予上述相同刺激方案和實(shí)驗(yàn)條件下，可以記錄到一個(gè)內(nèi)向整流混合電流，在浴液中加入10-7mol／L apamin后，內(nèi)向整流混合電流逐漸減小，在AF患者的心肌細(xì)胞記錄的SK2通道電流同樣具有apamin敏感性、內(nèi)向整流特性（圖 2）。

2.3 SR組與AF組的SK2通道電流比較

SR組與AF組的SK2通道電流都具有內(nèi)向整流性、apamin敏感性。將兩組的電流密度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果證實(shí)，AF組的SK2通道電流密度明顯大于SR組（nSR＝6，nAF＝3），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。

2.4 SR組患者心房肌細(xì)胞SK2通道電流的鈣敏感性

Fig.2 SK2 currents A：Inwardly rectifying and apamin-sensitive properties of SK2 currentswere recorded in AFgroup；B：Integrated inward currents recorded before and after application of apamin are depicted；SK2：Small conductance Ca2＋-activiated-K＋ channels；AF：Atrial fibrillation

在SR組心房肌細(xì)胞，當(dāng)電極內(nèi)游離鈣離子濃度接近0mol／L時(shí)，有較小的SK2通道電流被激活；當(dāng)電極內(nèi)游離鈣離子濃度靠近5×10-7mol／L，SK2通道電流不僅被激活，而且在原有的基礎(chǔ)增大，超級(jí)化方向更為顯著；當(dāng)電極內(nèi)游離鈣離子濃度超過(guò)生理濃度達(dá)到10-6mol／L左右時(shí)，SK2通道電流在超級(jí)化方向增大極為顯著（圖4）。這說(shuō)明SR組患者心房肌細(xì)胞的SK2通道電流具有鈣依賴(lài)性，隨著電極內(nèi)游離鈣離子的增加SK2通道電流的激活明顯，通道功能增強(qiáng)（n0＝7，＝6，＝8）。當(dāng)電極內(nèi)游離鈣離子濃度達(dá)到10-6mol／L左右時(shí)，SK2電流密度與前兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01）。

2.5 AF組心房肌細(xì)胞SK2通道電流的鈣敏感性

在AF組心房肌細(xì)胞，當(dāng)電極內(nèi)游離鈣離子濃度接近0mol／L時(shí)，有較小的SK2通道電流被激活；當(dāng)電極內(nèi)游離鈣離子濃度靠近5×10-7mol／L，SK2通道電流不僅被激活，而且在原有的基礎(chǔ)增大，超級(jí)化方向更為顯著；當(dāng)電極內(nèi)游離鈣離子濃度超過(guò)生理濃度達(dá)到10-6mol／L左右時(shí)，SK2通道電流在超級(jí)化方向增大極為顯著（圖5）。這說(shuō)明AF組患者心房肌細(xì)胞的SK2通道電流也具有明顯鈣依賴(lài)性。當(dāng)電極內(nèi)游離鈣離子濃度達(dá)到10-6mol／L左右時(shí)，SK2電流密度與前兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（n0＝4，n5×10-7＝3，n10-6＝4，P＜0.05，P＜0.01）

Fig.3 Differences of SK2 currents between AF and SR groups SK2：Small conductance Ca2＋-activiated K＋ channels；AF：Atrial fibrillation；SR：Sinus rhythm*P＜0.05，P＜0.01 vs SR group

Fig.4 Ca2＋-dependence properties of SK2 currents in SR group SK2：Small conductance Ca2＋-activiated K＋ channels；AF：Atrial fibrillation；SR：Sinus rhythm*P＜0.05 vs 5×10-7 group

2.6 SR組與AF組心房肌細(xì)胞SK2通道鈣離子敏感性的差異

SR組與AF組心房肌細(xì)胞SK2通道電流都具有鈣離子敏感性，本實(shí)驗(yàn)對(duì)電極內(nèi)游離鈣離子在各濃度時(shí)（0mol／L、5×10-7mol／L、10-6mol／L）的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：AF組的SK2通道電流密度在后兩種濃度時(shí)明顯大于SR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01，圖 6，nSR＝8，nAF＝4）。

Fig.5 Ca2＋-dependence properties of SK2 currents in AF group SK2：Small conductance Ca2＋-activiated-K＋ channels；AF：Atrial fibrillation represent the SK2 current density in different calcium concentration*P＜0.05，**P＜0.01 vs 5×10-7 group

Fig.6 Difference of Ca2＋-dependence properties of SK2 currents density between SR and AF groups SK2：Small conductance Ca2＋-activiated K＋ channels；SR：Sinus rhythm；AF：Atrial fibrillation*P＜0.05，**P＜0.01 vs SR group

3 討論

功能性SK通道包括兩種亞單位：α亞基和與之相連的鈣調(diào)蛋白（CaM）亞基，SK通道以四聚體形式存在：4個(gè)CaM亞基分別與4個(gè)α亞基相連。SK通道具有電壓不敏感性，其門(mén)控調(diào)節(jié)不由膜電位決定。SK通道對(duì)apamin敏感，且三種亞型對(duì)apamin的敏感程度不同，因此常將apamin作為SK通道特異性阻斷劑。

SK通道對(duì)鈣離子的高選擇性大于其他二價(jià)離子，SK通道的開(kāi)放與關(guān)閉與胞內(nèi)鈣離子濃度有關(guān)。生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度300～700 nmoL／L可將SK通道激活。SK通道功能對(duì)胞內(nèi)鈣離子存在依賴(lài)性，可隨胞內(nèi)鈣離子濃度的增高而增大。2009年，Weiyan Li等在卵母細(xì)胞上表達(dá)SK通道，在inside-out模式下記錄通道電流，隨著鈣離子濃度的增加，SK通道電流增大［5］。稀土元素離子 Tb3＋、Eu3＋等同樣可以激活SK2通道，鎂離子、鍶離子和鋇離子等二價(jià)陽(yáng)離子可抑制rSK2通道。因此，可利用這些特性來(lái)研究SK通道與二價(jià)離子之間的依賴(lài)關(guān)系。

我們的研究結(jié)果證實(shí)SK2通道電流具有以下特點(diǎn)：（1）通道電流具有明顯的鈣離子濃度依賴(lài)性。（2）通道的 Apamin敏感性：apamin是 SK2通道特異性阻斷劑，常用于對(duì)SK2通道的鑒別。本實(shí)驗(yàn)所記錄的內(nèi)向整流混合電流，浴液中加入10-7mol／L apamin后明顯減小，經(jīng)浴液洗脫電流可以基本恢復(fù)。這些結(jié)果提示該通道為2型小電導(dǎo)鈣激活鉀通道（SK2），其通道特性與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。

SK2通道的結(jié)構(gòu)決定其對(duì)鈣離子敏感而電壓依賴(lài)性不明顯，當(dāng)細(xì)胞外鈣離子進(jìn)入胞內(nèi)誘發(fā)肌漿網(wǎng)釋放鈣離子，使胞內(nèi)游離鈣離子濃度增加，激活SK2通道開(kāi)放，誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位超極化。KCa通道與胞內(nèi)游離鈣離子之間的關(guān)系并不簡(jiǎn)單。當(dāng)胞內(nèi)鈣離子發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，動(dòng)態(tài)的胞內(nèi)鈣信號(hào)可以調(diào)節(jié)KCa通道。在過(guò)表達(dá)KCa通道的HEK293細(xì)胞上，利嚕唑（SK通道激動(dòng)劑）處理可引起胞內(nèi)鈣震蕩，導(dǎo)致13%～50%的細(xì)胞通道激活，但是50%～76%的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化與通道電流的變化不同步，即出現(xiàn)鈣不依賴(lài)電流和電流不依賴(lài)鈣離子現(xiàn)象［6］。而這些復(fù)雜事件的機(jī)制還有待深入研究。

為研究鈣離子對(duì)人心房肌細(xì)胞SK2通道電流的調(diào)節(jié)作用，本實(shí)驗(yàn)使用二性霉素B和β-escin來(lái)配制穿孔電極液，進(jìn)行穿孔膜片鉗實(shí)驗(yàn)，改變電極液中鈣的濃度，觀(guān)察鈣離子對(duì)人心房肌細(xì)胞SK2通道的調(diào)控作用。當(dāng)穿孔全細(xì)胞模式形成后，電極內(nèi)液中的鈣離子進(jìn)入胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)鈣濃度被電極內(nèi)液稀釋?zhuān)藭r(shí)的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度約等于電極內(nèi)液中鈣的濃度，這種穿孔全細(xì)胞的記錄模式適用于胞內(nèi)游離鈣離子對(duì) SK2通道調(diào)控的研究［4］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明電極內(nèi)鈣離子濃度為5×10-7mol／L和10-6mol／L時(shí)，AF組 SK2通道電流明顯大于SR組，差異具有顯著性。結(jié)果提示AF時(shí)SK2通道對(duì)鈣離子的敏感性增強(qiáng)。

AF是臨床常見(jiàn)的持續(xù)性心律失常，AF患者心房肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高。AF發(fā)生時(shí)，動(dòng)作電位頻率加快，通過(guò) L-型鈣通道進(jìn)入胞內(nèi)的鈣離子增多，造成胞內(nèi)鈣超載。胞內(nèi)鈣超載可通過(guò)代償即鈣依賴(lài)式失活機(jī)制，使鈣通道失活；同時(shí)負(fù)反饋調(diào)節(jié)使L-型鈣通道密度降低，電流減小。但上述代償機(jī)制可導(dǎo)致動(dòng)作電位時(shí)程縮短，誘發(fā)AF。

本實(shí)驗(yàn)室之前研究報(bào)道持續(xù)性心房顫動(dòng)患者心房肌細(xì)胞SK2通道電流明顯增強(qiáng)［7］。有研究報(bào)道SK2通道在心肌細(xì)胞復(fù)極化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，間歇性快速起搏兔肺靜脈肌袖細(xì)胞能引起SK2通道基因、蛋白表達(dá)及電流水平增加，SK2通道向膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)增多，說(shuō)明SK2通道參與快速心律失常的發(fā)生。SK2通道電流增加，對(duì)Ca2＋敏感性增加，導(dǎo)致APD明顯縮短，更易誘發(fā)房性心律失常［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明SK2通道具有明顯的鈣依賴(lài)性，胞內(nèi)鈣濃度超過(guò)生理范圍時(shí)AF組SK2通道對(duì)鈣離子更敏感，表明AF的發(fā)生發(fā)展與SK2通道的功能變化可能相關(guān)。

Diness等研究發(fā)現(xiàn) SK通道的兩種阻滯劑NS8593和UCL1684可以降低SK通道對(duì)鈣離子的敏感性，影響SK通道特性。SK通道阻滯劑可以延長(zhǎng)心房動(dòng)作電位ERP，能夠預(yù)防和終止離體和在體的房顫模型［9］。但是，Li Ning等研究發(fā)現(xiàn)SK2基因敲除的小鼠心房肌細(xì)胞復(fù)極化末期延長(zhǎng)，這種情況下也容易誘發(fā)房顫，其機(jī)制是AP終末期對(duì)外源興奮敏感導(dǎo)致遲后去極化的發(fā)生［10］。這提示AF的發(fā)生不僅與SK2通道有關(guān)，而且與SK通道功能變化密切相關(guān)。

房室結(jié)組織的也有SK通道表達(dá)，SK通道的抑制劑或許可調(diào)節(jié)AF時(shí)的心室率，同樣SK通道的抑制劑對(duì)竇性心動(dòng)過(guò)速也能發(fā)揮作用。

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