豬苓菌絲體的化學成分研究△

陳曉梅，周微微，王春蘭，郭順星

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)科大學 藥用植物研究所，北京 100193)

豬苓菌絲體的化學成分研究△

陳曉梅，周微微，王春蘭，郭順星*

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)科大學 藥用植物研究所，北京 100193)

目的研究液體發(fā)酵豬苓菌絲體的化學成分。方法3000 L發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)豬苓菌絲體，95%乙醇提取，硅膠、凝膠等柱色譜方法純化化合物，紅外、質(zhì)譜、核磁共振等譜學技術(shù)鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。結(jié)果從豬苓菌絲體中分離鑒定了12個化合物，分別是：麥角甾醇(1)、麥角甾-7，22-二烯-3，5，6-三醇(2)、麥角甾-7，22-二烯-3-酮(3)、豬苓酮A(4)、豬苓酮B(5)、α-羥基二十四烷酸乙酯(6)、N-(2′-羥基二十四烷酰)-1，3，4-三羥基-2-十八鞘氨(7)、腺苷(8)、煙酸(9)、琥珀酸(10)、尿嘧啶(11)和尿苷(12)。結(jié)論化合物1～12均為首次從豬苓菌絲體中分離獲得。

豬苓；菌絲體；化學成分；甾體化合物

中藥豬苓來源于擔子菌綱多孔菌科多孔菌屬真菌豬苓Polyporusumbellatus(Pers)Fr.的干燥菌核，是一種常用的菌類藥材，在我國已經(jīng)有2 000多年的藥用歷史?，F(xiàn)代研究表明，豬苓菌核含有麥角甾醇、多糖及甾酮類化合物；其中的麥角甾-4，6，8(14)，22-四烯-3-酮是豬苓菌核利尿作用的主要活性成分[1-2]；包括豬苓酮A和B在內(nèi)的多種甾酮類化合物都具有細胞毒活性[3-5]；豬苓多糖具有抗腫瘤和提高機體免疫力的作用，其免疫刺激作用與TLR4信號通路的激活有關(guān)[6-8]。

隨著中藥豬苓抗腫瘤作用的發(fā)現(xiàn)，藥材用量快速增長，加之野生豬苓的繁殖能力很低，導致其自然資源日益枯竭。豬苓的生長發(fā)育需要經(jīng)歷擔孢子、菌絲體、菌核和子實體4個階段，其菌核的生長依靠蜜環(huán)菌提供營養(yǎng)，兩者之間形成共生關(guān)系[9]。在此基礎(chǔ)上發(fā)展建立的豬苓半野生栽培法雖然獲得了一定的成功，但該方法需要大量菌核作為種苓，種苓栽種后3～4年方能收獲，且產(chǎn)量不夠穩(wěn)定[10]。菌絲體是豬苓生長發(fā)育的一個必經(jīng)階段。有關(guān)液體發(fā)酵生產(chǎn)豬苓菌絲體及豬苓菌絲體多糖的研究較多[11-13]，菌絲體多糖能顯著提高小鼠的免疫功能[14]；也有一些以甾體類化合物為目的產(chǎn)物發(fā)酵生產(chǎn)豬苓菌絲體的研究[15-16]。但是，目前還沒有關(guān)于豬苓菌絲體小分子化學成分的研究報道。

為了闡明豬苓菌絲體和菌核的化學相關(guān)性，科學合理地開發(fā)利用豬苓菌絲體，筆者研究了液體發(fā)酵豬苓菌絲體的小分子化學成分，共分離純化得到12個化合物，分別鑒定為麥角甾醇(1)、麥角甾-7，22-二烯-3，5，6-三醇(2)、麥角甾-7，22-二烯-3-酮(3)、豬苓酮A(4)、豬苓酮B(5)、α-羥基二十四烷酸乙酯(6)、N-(2′-羥基二十四烷酰)-1，3，4-三羥基-2-十八鞘氨(7)、腺苷(8)、煙酸(9)、琥珀酸(10)、尿嘧啶(11)和尿苷(12)。以上成分均為首次從豬苓菌絲體中分離得到。

1 儀器與材料

X-4顯微熔點測定儀(溫度未校正)；Hitachi UV-2201 紫外/可見分光光度計；Impact 410 FT-IR型紅外光譜儀，KBr壓片；Varian INOVA 600型核磁共振儀，TMS為內(nèi)標；Bruker Daltonics APEX II FT-ICR-MS質(zhì)譜儀；柱色譜硅膠(青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20(Pharmacia公司)；GF254和HF254高效薄層板(青島海洋化工廠)；其他試劑均為分析純(北京化工廠)。

豬苓菌種為中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所生物技術(shù)中心保藏菌種，菌株編號GZ-06。生產(chǎn)流程：-80 ℃菌種→PDA斜面菌種→500 mL三角瓶液體種子→500 L種子罐發(fā)酵→3 000 L發(fā)酵罐發(fā)酵→板框過濾→真空干燥→粉碎→菌絲體粗粉。

三角瓶(500 mL)液體發(fā)酵條件：裝量200 mL，培養(yǎng)基組成：玉米面30 g·L-1、酵母膏30 g·L-1、磷酸二氫鉀1.0 g·L-1、硫酸鎂1.0 g·L-1、碳酸鈣 0.5 g·L-1、維生素B10.5 g·L-1，pH 6.0，溫度(25±1)℃，搖床轉(zhuǎn)速120 r·min-1，發(fā)酵15 d。一級種子罐(500 L)發(fā)酵條件：投料體積300 L，投料糊精6 kg，蛋白胨3.6 kg，酵母提取物1.2 kg，pH 6.2，溫度(25±1) ℃，通氣1∶0.5，不開攪拌，190 h轉(zhuǎn)接。發(fā)酵罐(3 000 L)發(fā)酵條件：投料體積2 000 L，投料玉米淀粉50 kg，豆餅粉30 kg，玉米漿50 kg，耐高溫α-淀粉酶30 g，pH 6.2，溫度(25±1)℃，通氣1∶0.5，間歇攪拌(每8 h攪拌10 min)，攪拌速度120 r·min-1，115 h終止。

2 提取與分離

豬苓菌絲體粗粉(約2 kg)，95%乙醇總用量為80 L，分3次回流提取，每次提取2 h，合并提取液，減壓回收溶劑，獲得總提取物浸膏320 g。將總提取物混懸于水中，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，獲得各部位浸膏187 g、15.2 g、14.6 g、32.7 g。取石油醚部位170 g進行硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，共得到22個組分(Fr.1～Fr.22)。組分Fr.8重結(jié)晶得到化合物1(10 g)；組分Fr.11～Fr.13合并后經(jīng)硅膠柱色譜[三氯甲烷-甲醇(95∶5)洗脫]，小流分fr.11得到化合物2(5 mg)，小流分fr.14得到化合物6(17 mg)；組分Fr.20～Fr.22合并后經(jīng)硅膠柱色譜[三氯甲烷-甲醇(95∶5)洗脫]，得到化合物3(5 mg)。取二氯甲烷部位12 g進行硅膠柱色譜，三氯甲烷-甲醇梯度洗脫，共得到20個組分(Fr.1～Fr.20)。組分Fr.16～Fr.17合并后經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜(甲醇洗脫)，得到化合物4(4 mg)和5(3 mg)；組分Fr.20經(jīng)硅膠柱色譜[三氯甲烷-甲醇(95∶5)洗脫]，得到化合物7(110 mg)。取乙酸乙酯部分12 g進行硅膠柱色譜，三氯甲烷-甲醇梯度洗脫，共得到10個組分(Fr.1～Fr.10)。組分Fr.1經(jīng)硅膠柱色譜[三氯甲烷-甲醇(9∶1)洗脫]，小流分fr.7～fr.11合并，經(jīng)反復重結(jié)晶，得到化合物8(100 mg)；組分Fr.3經(jīng)硅膠柱色譜[三氯甲烷-甲醇(93∶7)洗脫]，小流分fr.7經(jīng)重結(jié)晶，得到化合物9(20 mg)；組分Fr.7～Fr.10合并后經(jīng)Sephadex LH-20柱層析(甲醇洗脫)，小流分fr.14～fr.16合并，得到化合物10(30 mg)。取正丁醇部分30 g進行硅膠柱色譜，三氯甲烷-甲醇-水梯度洗脫，共得到10個組分(Fr.1～Fr.10)。組分Fr.1～Fr.3合并后反復重結(jié)晶，得到化合物11(5 g)；組分Fr.10經(jīng)重結(jié)晶，得到化合物12(200 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無色針狀結(jié)晶(三氯甲烷)。mp 151～152 ℃。ESI-MSm/z：396[M]+，與麥角甾醇對照品在多種展開系統(tǒng)中進行TLC比較，Rf值均一致，且與對照品混合熔點不下降，故鑒定化合物1為麥角甾醇(ergosterol)，為首次從豬苓菌絲體中分離獲得。

化合物2：白色粉末狀固體(三氯甲烷)。EI-MSm/z：430[M]+。1H-NMR(py-d5，600 MHz)δ：5.26(1H，dd，J=15.6，7.8 Hz，H-23)，5.21(1H，dd，J=15.6，7.8 Hz，H-22)，5.16(1H，m，H-7)，4.82(1H，m，H-3)，4.31(1H，br.s，H-6)，1.06(3H，d，J=6.6 Hz，Me-21)，0.94(3H，d，J=6.6 Hz，Me-28)，0.86(3H，d，J=6.6 Hz，Me-26)，0.81(3H，d，J=6.6 Hz，Me-27)，0.66(3H，s，Me-18)；13C-NMR(py-d5，150 MHz)δ：141.5(C-8)，136.2(C-22)，132.1(C-23)，120.5(C-7)，76.1(C-5)，74.3(C-6)，67.6(C-3)，56.1(C-17)，55.2(C-14)，43.8(C-9)，43.8(C-13)，43.1(C-24)，42.0(C-4)，40.9(C-20)，39.9(C-12)，38.1(C-10)，33.8(C-1)，33.3(C-25)，32.7(C-2)，28.5(C-16)，23.5(C-11)，22.4(C-15)，21.4(C-21)，20.1(C-26)，19.8(C-27)，18.8(C-19)，17.8(C-28)，12.5(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的麥角甾-7，22-二烯-3，5，6-三醇(ergosta-7，22-dien-3，5，6-triol)基本一致[17]，為首次從豬苓菌絲體中分離獲得。

化合物3：白色片狀結(jié)晶(三氯甲烷)。mp 186～187 ℃。EI-MSm/z：396[M]+。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δ：5.19(3H，m，H-7，22，23)，1.03(3H，s，Me-21)，1.02(3H，s，Me-19)，0.92(3H，d，J=6.6 Hz，Me-28)，0.84(3H，d，J=6.6 Hz，Me-26)，0.82(3H，d，J=6.6 Hz，Me-27)，0.58(3H，s，Me-18)；13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δ：211.9(C-3)，139.5(C-8)，135.6(C-22)，132.0(C-23)，117.0(C-7)，55.9(C-17)，55.0(C-14)，48.9(C-9)，44.2(C-4)，43.3(C-13)，42.9(C-5)，42.8(C-24)，40.5(C-20)，39.3(C-12)，38.8(C-1)，38.1(C-2)，34.4(C-10)，33.1(C-25)，30.1(C-6)，28.1(C-16)，22.9(C-15)，21.7(C-11)，21.1(C-21)，19.9(C-26)，19.6(C-27)，17.6(C-28)，12.4(C-19)，12.1(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的麥角甾-7，22-二烯-3-酮(ergosta-7，22-dien-3-one)基本一致[18]，為首次從豬苓菌絲體中分離獲得。

化合物4：無色針狀結(jié)晶(甲醇)。mp 261～262 ℃。EI-MSm/z：442[M-2H2O]+，363[M-C6H11]+，345[M-C6H11-H2O]+(基峰)，327，309，269，71。1H-NMR(py-d5，600 MHz)δ：6.27(1H，d，J=2.4 Hz，H-7)，4.23(1H，br.s，H-3)，4.17(1H，br.d，H-2)，3.92(1H，dd，J=9.6，4.8 Hz，H-22)，3.60(1H，br.t，J=8.4Hz，H-9)，2.93(1H，t，J=9.0Hz，H-17)，1.57(3H，s，Me-21)，1.43(1H，septed，J=6.6Hz，H-25)，1.23(3H，s，Me-18)，1.08(3H，s，Me-19)，0.87(3H，d，J=7.2Hz，Me-26)，0.85(3H，d，J=6.6Hz，Me-27)，0.74(3H，d，J=6.6Hz，Me-28)；13C-NMR(py-d5，150 MHz)δ：15.7(C-27)，16.0(C-26)，17.9(C-18)，21.1(C-11)，21.4(C-28)，21.4(C-21)，21.5(C-12)，24.5(C-19)，29.5(C-25)，31.7(C-16)，32.1(C-15)，32.5(C-4)，34.5(C-9)，36.1(C-24)，37.3(C-23)，38.0(C-1)，38.7(C-10)，48.1(C-13)，49.9(C-17)，51.4(C-5)，68.1(C-3)，68.1(C-2)，74.5(C-22)，76.8(C-20)，84.1(C-14)，121.1(C-7)，166.2(C-8)，203.5(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的豬苓酮A(polyporusterone A)基本一致[3]，為首次從豬苓菌絲體中分離獲得。

化合物5：無色針狀結(jié)晶(甲醇)。mp 250～251 ℃。EI-MSm/z：440[M-2H2O]+，422，363[M-C6H11]+，345[M-C6H11-H2O]+(基峰)，327，269，69。1H-NMR(py-d5，600 MHz)δ：6.26(1H，d，J=2.4 Hz，H-7)，4.95(1H，br.s，H-28a)，4.85(1H，br.s，H-28b)，4.24(1H，br.s，H-3)，4.19(1H，br.d，H-2)，4.04(1H，dd，J=9.0，4.2 Hz，H-22)，2.95(1H，t，J=9.0 Hz，H-17)，2.61(2H，m，H-23)，2.41(1H，septed，J=6.6 Hz，H-25)，1.59(3H，s，Me-21)，1.22(3H，s，Me-18)，1.07(3H，s，Me-19)，1.03(3H，d，J=6.6 Hz，Me-26)，1.01(3H，d，J=6.6Hz，Me-27)；13C-NMR(py-d5，150 MHz)δ：17.9(C-18)，21.2(C-11)，21.5(C-21)，21.6(C-12)，21.9(C-27)，22.1(C-26)，24.5(C-19)，31.8(C-16)，32.1(C-15)，32.5(C-4)，33.7(C-25)，34.5(C-9)，38.0(C-1)，38.4(C-23)，38.8(C-10)，48.2(C-13)，50.0(C-17)，51.5(C-5)，68.1(C-3)，68.2(C-2)，75.4(C-22)，76.8(C-20)，84.2(C-14)，108.7(C-28)，121.7(C-7)，154.4(C-24)，166.2(C-8)，203.7(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的豬苓酮B(polyporusterone B)基本一致[3]，為首次從豬苓菌絲體中分離獲得。

化合物6：白色片狀結(jié)晶(三氯甲烷-甲醇)。mp 65～66 ℃。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δ：4.24(2H，m，H-1′)，4.16(1H，dd，J=7.8，4.2 Hz，H-2)，2.69(1H，br.s，2-OH)，1.78(1H，m，H-3a)，1.63(1H，m，H-3b)，0.88(3H，t，J=7.2 Hz，Me-24)；13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δ：175.5(C-1)，70.5(C-1′)，61.6(C-2)，34.5(C-3)，31.9(C-4)，29.7-29.6(亞甲基碳信號，重疊)，29.6(C-21)，29.5(C-22)，29.4(C-23)，29.3(C-24)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的α-羥基二十四烷酸乙酯(α-hydroxytetracosanoic ethyl ester)基本一致[19]，為首次從豬苓菌絲體中分離獲得。

化合物7：白色無定形粉末(三氯甲烷)。mp 141～142 ℃。EI-MSm/z：665[M-H2O]+。1H-NMR(py-d5，600 MHz)δ：8.57(1H，s，J=9.0 Hz，NH)，5.11(1H，ddd，J=9.0，4.8，4.8 Hz，H-2)，4.62(1H，dd，J=7.8，3.6 Hz，H-2′)，4.51(1H，dd，J=10.8，5.4 Hz，H-1b)，4.42(1H，dd，J=10.8，5.4 Hz，H-1a)，4.35(1H，dd，J=6.0，5.4Hz，H-3)，4.28(1H，m，H-4)，2.24(1H，m，H-5)，2.22(1H，m，H-3′b)，2.04(1H，m，H-3′a)，1.94(1H，m，H-5)，1.93(1H，m，H-6b)，1.71(1H，m，H-6a)，0.87(6H，m，18-CH3and 24-CH3)；13C-NMR(py-d5，150 MHz)δ：175.2(C-1′)，76.8(C-3)，73.0(C-4)，72.4(C-2′)，62.1(C-1)，53.0(C-2)，35.7(C-3′)，34.2(C-5)，26.6(C-6)，22.9(C-17)，14.3(C-18，C-24′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的N-(2′-羥基二十四烷酰)-1，3，4-三羥基-2-十八鞘氨[N-(2′-hydroxytetracosanoyl)-1，3，4-trihydroxyl-2-octodecanine]基本一致[20]，為首次從豬苓菌絲體中分離獲得。

化合物8：白色粉末狀固體(甲醇)。mp 226～227 ℃。EI-MSm/z：268[M+H]+，237[M-H2O]+，178，164，135(基峰)，108。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：8.35(1H，s，H-2)，8.14(1H，s，H-8)，7.37(2H，s，-NH2)，5.20(1H，d，J=4.6Hz，H-1′)，4.61(1H，dd，J=11.3，6.3Hz，H-4′)，4.14(1H，dd，J=7.6，4.6Hz，H-2′)，3.96(1H，dd，J=6.3，3.4Hz，H-3′)，3.67(1H，m，H-5′a)，3.55(1H，m，H-5′b)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：156.1(C-6)，152.3(C-2)，149.0(C-4)，139.9(C-8)，119.3(C-5)，87.9(C-1′)，85.9(C-4′)，73.4(C-2′)，70.6(C-3′)，61.7(C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的腺苷(adenosine)基本一致[21]，且與腺苷對照品混合熔點不下降，為首次從豬苓菌絲體中分離獲得。

化合物9：無色針狀結(jié)晶(水)。EI-MSm/z：123[M]+，106[M-NHCO]+，42[M-NHCO-HCN]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：13.45(1H，s，COOH)，9.07(1H，d，J=2.1 Hz，H-2)，8.80(1H，dd，J=4.8，1.6 Hz，H-6)，8.27(1H，m，H-4)，7.55(1H，m，H-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的煙酸(nicotinic acid)基本一致[22]，為首次從豬苓菌絲體中分離獲得。

化合物10：無色針狀結(jié)晶(甲醇)。mp 186～187 ℃。EI-MSm/z：119[M+H]+，100[M-H2O]+，74[M-CO2]+，56，44。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：2.16(4H，m，H-2，3)。13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：177.3(C-1，4)，29.8(C-2，3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的琥珀酸(succinic acid)基本一致[23]，為首次從豬苓菌絲體中分離獲得。

化合物11：褐色無定形粉末狀固體(三氯甲烷-甲醇)。mp>320 ℃。EI-MSm/z：112[M]+，69[M-NHCO]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：11.0(1H，s，NH-1)，10.79(1H，s，NH-3)，7.38(1H，dd，J=7.5，5.7 Hz，H-5)，5.44(1H，d，J=7.7 Hz，H-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的尿嘧啶(uracil)基本一致[24]，且與尿嘧啶對照品混合熔點不下降，為首次從豬苓菌絲體中分離獲得。

化合物12：白色粉末狀固體(甲醇)。mp 166～167 ℃。Molish 反應呈陽性。EI-MSm/z：245[M+H]+，226，155，133，131，113(基峰)，73。1H-NMR(D2O，600 MHz)δ：11.3(1H，s，-NH)，7.88(1H，d，J=8.2 Hz，H-6)，5.78(1H，d，J=5.2 Hz，H-1′)，5.64(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，4.00(1H，m，H-4′)，3.95(1H，m，H-3′)，3.85(1H，m，H-2′)，3.61(1H，m，H-5′a)，3.54(1H，dd，J=12.2，2.4 Hz，H-5′b)；13C-NMR(D2O，150 MHz)δ：163.1(C-4)，150.7(C-2)，140.7(C-6)，101.8(C-5)，87.7(C-1′)，84.8(C-4′)，73.6(C-3′)，69.9(C-2′)，60.9(C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的尿苷(uridine)基本一致[25]，為首次從豬苓菌絲體中分離獲得。

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StudyonChemicalConstituentofMyceliumofPolyporusumbellatus(Pers.)Fries.

CHENXiaoMei，ZHOUWeiWei，WANGChunLan，GUOShunxing*

(InstituteofMedicinalPlantsDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China)

Objective：To study the chemical constituents of mycelium ofPolyporusumbellatus(Pers)Fries.by liquid fermentation.MethodsLiquid fermentation was performed in 3 000 L fermentor.Mycelium ofP.umbellatuswas extracted by 95% ethanol.Chemical constituents were isolated and purified using silica gel and Sephadex LH-20 column.IR，MS and NMR spectral analysis were used to identify their structures.ResultsTwelve compounds were isolated from mycelium ofP.umbellatusand identified as：ergosterol(1)，ergosta-7，22-dien-3，5，6-triol(2)，ergosta-7，22-dien-3-one(3)，polyporusterone A(4)，polyporusterone B(5)，α-hydroxytetracosanoic ethyl ester(6)，N-(2′-hydroxytetracosanoyl)-1，3，4-trihydroxyl-2-octodecanine(7)，adenosine(8)，nicotinic acid(9)，succinic acid(10)，uracil(11)，and uridine(12).ConclusionCompounds1-12were isolated from mycelium ofP.umbellatusfor the first time.

Polyporusumbellatus；Mycelium；Chemical constituent；Steroids

國家自然科學基金(31201666)

*

郭順星，研究員，博士生導師，研究方向：珍稀瀕危藥用植物菌根生物學；Tel：(010)62829619，E-mail：sxguo1986@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.03.003

2013-11-18)