基于統(tǒng)計(jì)分析研究東北園參皂苷含量的影響因素△

趙伯友，姜國(guó)志，孫勝斌，陳翔宇，馮玉康

(神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430)

基于統(tǒng)計(jì)分析研究東北園參皂苷含量的影響因素△

趙伯友，姜國(guó)志，孫勝斌*，陳翔宇，馮玉康

(神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430)

目的研究東北園參擴(kuò)增北移后對(duì)質(zhì)量的影響，考察不同產(chǎn)地、年限、采收期等因素對(duì)東北園參中皂苷Rg1+Re和Rb1的含量的影響。方法采用HPLC法測(cè)定，數(shù)據(jù)分析采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)和單因素方差分析及多元線性回歸。結(jié)果東北園參中人參皂苷Rg1+Re和Rb1含量水平均受產(chǎn)地與生長(zhǎng)年限和采收期影響，影響從大到小的順序是：產(chǎn)地>生長(zhǎng)年限>采收期。生曬過(guò)程對(duì)人參皂苷Rg1+Re和Rb1含量水平影響不大。結(jié)論以人參皂苷Rg1+Re和Rb1含量水平為參考，人參種植北移后，其含量雖然偏低，但仍然可以滿足2010年版《中國(guó)藥典》要求；生曬過(guò)程對(duì)質(zhì)量影響不大，東北園參中吉林質(zhì)地為佳，藥用人參五年生優(yōu)于四年生，7～9月采收期內(nèi)，隨時(shí)間推移含量依次升高，9月最高。藥用人參最佳選擇仍應(yīng)為五年生9月采收吉林產(chǎn)的園參。

人參皂苷；統(tǒng)計(jì)分析；影響因素

人參為五加科Araliaceae植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根，具有大補(bǔ)元?dú)?、補(bǔ)脾益肺、生津止渴、安神益智的功效，其中人參皂苷是其主要活性成分。人參皂苷(ginsenoside)為人參的一類具有特征性活性成分，人參質(zhì)量的優(yōu)劣取決于總皂苷和各單體皂苷含量的多寡及比例[1-3]。園參道地藥材主產(chǎn)于東三省，園參原主產(chǎn)于吉林[4]，近年來(lái)，隨藥材需求逐年增加，原吉林園參產(chǎn)量難以滿足用藥需求，因此園參的栽培有“擴(kuò)增北移現(xiàn)象”，最北已經(jīng)擴(kuò)至黑龍江小興安嶺黑河遜克一帶，目前，僅遜克縣及周邊地區(qū)種植已經(jīng)達(dá)到上萬(wàn)畝，針對(duì)這一現(xiàn)象，本文以人參皂苷Rg1+Re和Rb1含量作為參考，選取黑龍江遜克和吉林集安南北兩個(gè)代表產(chǎn)地的人參進(jìn)行對(duì)比研究，以考察園參種植北移新產(chǎn)地后，對(duì)人參質(zhì)量的影響，同時(shí)考察生長(zhǎng)年限、生曬過(guò)程、采挖期對(duì)園參的影響。在研究中，不同產(chǎn)地、生長(zhǎng)年限、采收期等因素對(duì)人參中皂苷及非皂苷類成分的影響也時(shí)有報(bào)道，但對(duì)影響因素未進(jìn)行深一步的數(shù)據(jù)分析，未充分展示出因素重要性順序。本文為了評(píng)價(jià)各因素對(duì)人參中人參皂苷Rg1+Re、Rb1的含量的影響，基于統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)各因素的重要性進(jìn)行了排序。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀(美國(guó)沃特斯公司)；UV-2550紫外分光光度(日本島津公司)；電子天平(德國(guó)賽多利斯)。

1.2 試劑

乙腈為HPLC級(jí)，其余試劑均為AR級(jí)；實(shí)驗(yàn)用水為純化水，人參皂苷Rg1、Re及Rb1對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品鑒定研究院，批號(hào)分別為110703-201128，110754-201123，110704-201223。

1.3 藥材

分別自吉林集安和黑龍江遜克兩地采挖后，當(dāng)?shù)刭?gòu)買。按四年和五年，鮮貨和生曬，不同采挖期進(jìn)行分類。藥材由河北省藥品檢驗(yàn)所孫寶惠老師鑒定為五加科Araliaceae植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根。

2 方法

2.1 人參中皂苷Rg1+Re、Rb1的含量測(cè)定

按照2010年版《中國(guó)藥典》人參項(xiàng)下相應(yīng)方法測(cè)定人參皂苷Rg1+Re、Rb1的含量[5]。

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm。理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計(jì)算應(yīng)不低于6 000。

對(duì)照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Re對(duì)照品及人參皂苷Rb1對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL各含0.2 mg的混合溶液，搖勻，即得。

表1 人參皂苷含量測(cè)定流動(dòng)相梯度洗脫條件

供試品溶液的制備 鮮品：將園參剪碎，60 ℃以下減壓干燥4小時(shí)后粉碎(過(guò)四號(hào)篩)，再于105 ℃干燥2小時(shí)后，取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加熱回流3 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙移入100 mL錐形瓶中，精密加水飽和正丁醇50 mL，密塞，放置過(guò)夜，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz) 30 min，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液25 mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

干品：將園參洗凈后于日光下曬干后得生曬參，粉碎(過(guò)四號(hào)篩)后再于105 ℃干燥2 h后，取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加熱回流3 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒移入100 mL錐形瓶中，精密加水飽和正丁醇50 mL，密塞，放置過(guò)夜，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz) 30分鐘，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液25 mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液10 μL與供試品溶液10～20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.2 數(shù)據(jù)處理與分析方法

2.2.1 數(shù)據(jù)處理與分析 均采用SPSS11.5完成，所有分析結(jié)果直接引用軟件生成的表格設(shè)定。

2.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù) 先對(duì)二分類因素人參產(chǎn)地、生長(zhǎng)年限、干鮮進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立樣本的T檢驗(yàn)以初步分析此三因素對(duì)人參皂苷Rg1+Re和Rb1的含量的影響；再對(duì)多分類因素采收期進(jìn)行單因素方差分析，以分析出不同采收期對(duì)人參皂苷Rg1+Re和Rb1的含量的具體變化情況及影響；最后采用線性回歸模型對(duì)可能的影響因素進(jìn)行回歸分析，以評(píng)價(jià)影響因素的重要性次序并可定量評(píng)估:

3 結(jié)果與分析

3.1 不同產(chǎn)地和年限的園參中人參皂苷含量情況，見(jiàn)表2。

表2 不同產(chǎn)地和年限的園參中人參皂苷Rg1+Re和Rb1的含量結(jié)果

注：干鮮中“1”表示生曬干品，“2”表示采挖后鮮品

3.2 以SPSS11.5進(jìn)行分析

3.2.1 因素分析：獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)與單因素方差分析

其中人參干鮮、產(chǎn)地、生長(zhǎng)年限三因素均用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3、表4及表5。

表3 干鮮對(duì)人參皂苷Rg1+Re和Rb1的影響

表4 產(chǎn)地對(duì)人參皂苷Rg1+Re和Rb1的影響

**顯著性差異在0.01水平

表5 生長(zhǎng)年限對(duì)人參皂苷Rg1+Re和Rb1的影響

從上面初步分析可以看出，人參采挖后干貨與鮮貨對(duì)人參皂苷Rg1+Re和Rb1的影響不顯著，即說(shuō)明生曬過(guò)程對(duì)人參皂苷Rg1+Re和Rb1的含量無(wú)明顯影響。其中產(chǎn)地對(duì)人參皂苷Rg1+Re和Rb1產(chǎn)生極其顯著影響，生長(zhǎng)年限則可能產(chǎn)生顯著影響。

采收期采用單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性性分析，由方差齊性檢驗(yàn)知數(shù)據(jù)方差齊，因此采用LSD法進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 不同采收期園參中人皂苷Rg1+Re和Rb1多重比較結(jié)果

從上面初步分析也可以看出，采收期7月至8月采收人參皂苷Rg1+Re和Rb1有顯著差異，含量均值分別升高0.13%和0.10%(g/g)，但至9月采收時(shí)，雖然在均值上有很小升高，但較8月無(wú)明顯差異。因此，采收期可能對(duì)人參皂苷Rg1+Re和Rb1產(chǎn)生顯著影響。

根據(jù)上述初步分析，可以估計(jì)人參的干鮮對(duì)人參皂苷Rg1+Re和Rb1的影響不顯著，產(chǎn)地、生長(zhǎng)年限、采收期可能顯著影響人參皂苷Rg1+Re和Rb1含量。下面進(jìn)一步對(duì)該三因素重要性進(jìn)行分析。

3.2.2 因素重要性分析：回歸分析

以上述人參產(chǎn)地、生長(zhǎng)年限、采收期三個(gè)因素進(jìn)行分析，因現(xiàn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中，人參產(chǎn)地為二分類變量、生長(zhǎng)年限、采收期為有序分類變量，符合多元線性回歸條件，因此，采用多元線性回歸分析該三因素分別對(duì)人參皂苷Rg1+Re和Rb1影響的重要性。結(jié)果如下：

3.2.2.1 對(duì)人參皂苷Rg1+Re的影響 采用BACKWARD方法進(jìn)行回歸分析，結(jié)表見(jiàn)表7、表8及表9。

表7 人參皂苷Rg1+Re影響因素線性回歸模型概述

a模型1預(yù)測(cè)的R值

表8 人參皂苷Rg1+Re影響因素線性回歸模型方差分析b

b因變量是人參皂苷Rg1+Re

表9 人參皂苷Rg1+Re影響因素線性回歸模型系數(shù)b分析

b因變量是人參皂苷Rg1+Re

分析過(guò)程建立了一個(gè)模型，方差分析有顯著意義，但模型回歸采收期系數(shù)不顯著(0.052接近顯著水平0.05，因此納入回歸方程)，從該模型標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)Beta值可以看出，從主到次影響人參皂苷Rg1+Re含量的順序是產(chǎn)地>年限>采收期。最終回歸方程為：人參皂苷Rg1+Re含量=-0.147×產(chǎn)地+0.083×年限+0.038×采收期-0.017。該回歸方程的意義在于，產(chǎn)地1(吉林集安)較產(chǎn)地2(黑龍江遜克)高，五年生人參較四年生人參高，7～9月人參皂苷Rg1+Re含量依次升高，且產(chǎn)地對(duì)人參中Rg1+Re含量的影響較年限大。

3.2.2.2 對(duì)人參皂苷Rb1的影響 采用BACKWARD方法進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表10、表11及表12。

表10 人參皂苷Rb1影響因素線性回歸模型概述

c模型2預(yù)測(cè)的R值

表11 人參皂苷Rb1影響因素線性回歸模型方差d

d因變量是人參皂苷Rb1

表12 人參皂苷Rb1影響因素線性回歸模型系數(shù)d分析

d因變量是人參皂苷Rb1

分析過(guò)程建立了一個(gè)模型，方差分析有顯著意義，從該模型標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)Beta值可以看出，從主到次影響人參Rb1含量的順序是產(chǎn)地>年限>采收期。最終回歸方程為：人參皂苷Rb1含量=-0.093×產(chǎn)地+0.081×年限+0.038×采收期-0.193。該回歸方程的意義在于：產(chǎn)地1(吉林集安)較產(chǎn)地2(黑龍江遜克)高，五年生人參較四年生人參高，7～9月人參Rb1含量依次升高，且產(chǎn)地對(duì)人參中Rb1含量的影響較年限大。

4 討論

本文選取黑龍江和吉林兩個(gè)產(chǎn)地以園參主產(chǎn)地為要求，以考察園參“擴(kuò)增北移”現(xiàn)象對(duì)人參皂苷Rg1+Re和Rb1含量的影響；由于人參加工過(guò)程可能對(duì)質(zhì)量產(chǎn)生影響[6]，因此生鮮因素選擇主要考慮生曬加工過(guò)程對(duì)含量的影響；以人參的傳統(tǒng)采收期為依據(jù)，因此選取7～9月采收的人參并考慮采收期內(nèi)人參皂苷Rg1+Re和Rb1含量的變化情況；制藥用園參的生長(zhǎng)年限一般為4～5年[7]，因此選擇這兩年做為研究對(duì)象。

園參種植擴(kuò)增北移后，兩個(gè)產(chǎn)地不同采收期和年限的人參皂苷Rg1+Re和Rb1含量雖均可符合2010年版《中國(guó)藥典》要求，但最佳選擇仍為原主產(chǎn)地吉林，這對(duì)高質(zhì)量控制水平如中藥注射劑原料控制具有重要意義，只有對(duì)產(chǎn)地、采收期、生長(zhǎng)年限等明顯影響以人參皂苷為代表的人參皂苷Rg1+Re和Rb1含量的因素得到有效控制，才能在源頭上控制注射劑質(zhì)量，才能充分保證注射劑質(zhì)量的均一性。采用統(tǒng)計(jì)分析方法可進(jìn)一步科學(xué)的分析出各影響因素的重要性，有利于進(jìn)一步探索數(shù)據(jù)，全面控制藥材質(zhì)量。

雖然人參皂苷影響因素線性回歸方程常數(shù)項(xiàng)不顯著，但回歸因素通過(guò)了檢驗(yàn)，仍可認(rèn)為回歸方程有意義。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和分析得知，各影響因素里人參中人參皂苷Rg1+Re和Rb1的含量水平受產(chǎn)地與生長(zhǎng)年限影響較大，其中人參皂苷Rg1+Re和Rb1含量水平受產(chǎn)地影響最大[8]，生長(zhǎng)年限次之，采收期再次之。這與人參在5年內(nèi)隨著生長(zhǎng)年限增長(zhǎng)人參皂苷Rg1含量有所增加，以人參皂苷Rg1+Re和Rg1+Re+Rb1含量增長(zhǎng)趨勢(shì)更為明顯的結(jié)果相符[9-11]。鮮品與干品對(duì)Rg1+Re和Rb1含量水平無(wú)明顯差異，這說(shuō)明生曬加工過(guò)程對(duì)人參皂苷Rg1+Re和Rb1含量影響不大。

另外，多元線性回歸僅是對(duì)因變量與考察因素間的簡(jiǎn)單線性模擬，因此，回歸方程用于預(yù)測(cè)時(shí)需充分考慮考察因素是否獨(dú)立且與因變量是否為簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，同時(shí)需要考慮擬合的整體效果與實(shí)際的解釋意義。對(duì)于因素重要性研究，多元線性回歸中標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)絕對(duì)大小可以清晰地說(shuō)明重要性順序。

本實(shí)驗(yàn)僅從Rg1+Re和Rb1含量水平考察了對(duì)人參的影響程度，其它如浸出物、揮發(fā)油、灰分、指紋圖譜等同樣影響人參質(zhì)量的檢查項(xiàng)仍需進(jìn)一步研究。該方法僅為藥材質(zhì)量分析考察提供了一種思路。

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TheGinsenosideContentinNortheastGinsengBasedonTheStatisticalAnalysisofInfluencingFactors

ZHAO Boyou，JIANG Guozhi，SUN Shengbin*，CHEN Xiangyu，F(xiàn)ENG Yukang

(ShinewayPharmaceuticalCo.，Ltd.，Shijiazhuang051430，China)

Objective：To study the effect of Northeast ginseng amplification northwards on quality，effect on ginsenoside Rg1+Re and ginsenoside Rb1content in northeast ginseng from different origin，age and harvest time.MethodsThe content was determined by HPLC，and the data was analyzed by independent samples T-test，single-factor analysis of variance and multiple linear regressions.ResultsThe origin，age and havest time effected ginsenoside Rg1+Re and ginsenoside Rb1contend in northeast ginseng，the impact on decreasing order was:the origin>growth age>harvest time.The effect on the ginsenoside Rg1+Re and ginsenoside Rb1content from fresh and dried sample was unremakeble.ConclusionWith ginsenoside Rg1+Re and Rb1level as reference，Ginseng planting northwards，although its content is low，but still can meet the requirements of Pharmacopoeia 2010 edition，raw drying process on the quality have no significant differences，the Northeast ginseng in Jilin texture is good，5 years old than 4 years old，7-9 month recovery period，with the passage of time in September the highest increase in turn.the best choice of ginseng should be harvested in September Jilin ginseng 5 years.

Ginsenoside; Statistical analysis; Influencing factors

國(guó)家重大新藥創(chuàng)制專項(xiàng)項(xiàng)目(2011ZX09201-201)

*

孫勝斌，工程師，研究方向：中藥及制劑研究，Tel：(0311)88030066-6532，E-mail：sunshengbin2003@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.03.012

*顯著性差異在0.05水平的平均差

2013-06-26)