丹參滴注液一測多評法可行性研究

范步高，戴騰順

(上海長征富民金山制藥有限公司，上海 201506)

丹參滴注液一測多評法可行性研究

范步高*，戴騰順

(上海長征富民金山制藥有限公司，上海 201506)

目的評估將一測多評法(QAMS)應用于檢測丹參滴注液多指標含量的可行性。方法采用回顧性研究和Excel模型處理法，建立QAMS的“最優(yōu)”一元線性方程，并用相對偏差、t檢驗、相關(guān)系數(shù)、相似度等評價方法對方程的預測值(QAMS計算值：y預測)與實測值(常規(guī)法實測值：y實測)的差異進行統(tǒng)計學檢驗、比較和篩選。結(jié)果在甄別和剔除異常數(shù)據(jù)的前提下，以兩種不同方法來源的相對校正因子f丹參素鈉/原兒茶醛為斜率的“最優(yōu)”一元線性方程，其y預測與y實測差異均無統(tǒng)計學意義，平均相對偏差也均小于5%，表明QAMS的測定結(jié)果準確可靠。結(jié)論QAMS應用于丹參滴注液含量檢測，更能體現(xiàn)生產(chǎn)所需的簡便、低成本的特點，可以作為除丹參滴注液質(zhì)量標準規(guī)定之外的一種新的含量檢測方法。

一測多評法；相對校正因子；異常值檢驗；質(zhì)量控制；Excel；丹參滴注液

中藥與化學藥的最大區(qū)別在于單味中藥的復方性，即單味中藥即能協(xié)同本身所具有的多種有效成分發(fā)揮出最佳的藥用療效，所以，中藥的質(zhì)量與提取工藝息息相關(guān)的根本是為控制其有效成分的“質(zhì)”與“量”的相對穩(wěn)定性。目前現(xiàn)行國家標準一般是用相應的對照品對各重要指標成分的含量逐一進行檢測，或因其對照品穩(wěn)定性較差難以獲得而免予檢測，故較大制約了中藥質(zhì)量標準的整體提高。為解決這一問題，現(xiàn)已有較多學者研究并撰文提供了內(nèi)標多控法、替代對照品法、系統(tǒng)內(nèi)標法、加校正因子的主成分對照法、一測多評法(QAMS)等新的測定方法[1-3]。筆者以丹參滴注液為實例，對QAMS的可行性進行回顧性研究和驗證。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀(安捷倫1100)。

丹參滴注液及中間品(上海長征富民金山制藥有限公司)，丹參素鈉對照品(批號：110855-200809)、原兒茶醛對照品(批號：110810-201007)均購自中國食品藥品檢定研究院，5-羥甲基糠醛對照品(批號：102k3450，SIGMA，含量為99%)。

2 檢測方法

丹參素鈉、原兒茶醛含量測定及5-羥甲基糠醛限度檢查，依據(jù)丹參滴注液質(zhì)量標準[4]進行測定(外標一點法)。

3 QAMS研究

3.1 原理

QAMS等諸多新法盡管名稱各異，但若究其原理則基本相同，均是將HPLC法的A、B成分相對校正因子fBA(下標BA表示B對A的相對性，下同)視為常數(shù)。假設(shè)f、c、s分別表示校正因子、濃度、峰面積；下標A、B或Ar、Br分別表示樣品或?qū)φ掌稟、B成分。在對樣品進行檢測時，A濃度按常規(guī)法檢測：cA=sA·cAr/sAr，B濃度則(省略對照品)通過fBA進行計算：cB=fBA·sB·cA/sA，所不同的僅是求取fBA的計算方法。

對于fBA，常用的計算方法主要分為兩種：一種是標準曲線法，即應用B、A標準曲線的斜率比值求得fBA；另一種是平均值法，即以不同進樣量測得B、A的fB、fA的平均值之比作為fBA[5-6]。本次研究則采用直接對cBA～sBA進行線性回歸的方法，將得到的斜率作為fBA進行QAMS計算。

3.2 數(shù)據(jù)采集

采用回顧性研究，將原兒茶醛設(shè)定為成分A(價格相對便宜)，丹參素鈉為成分B，按時間順序采集近期供試品(丹參滴注液樣品按10倍量稀釋)含量檢測結(jié)果(cB、cA，計量單位μg·mL-1)及相應的峰面積(sB、sA)，分別計算cBA=cB/cA及sBA=sB/sA，共計26組數(shù)據(jù)，見表1。

表1 丹參滴注液樣品檢測數(shù)據(jù)

注：加框序號組數(shù)據(jù)經(jīng)后續(xù)檢驗甄別為異常數(shù)據(jù)

3.3 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果

對采集的26組cBA～sBA數(shù)據(jù)，分別進行零截距和非零截距線性回歸，得到方程Y0：cBA=fBA0·sBA和Y1：cBA=fBA1·sBA+a。

fBA0或fBA1及a等回歸統(tǒng)計值可以通過Excel的函數(shù)得到[7]：將cBA～sBA數(shù)據(jù)輸入Excel中，在空白處選中5行2列，輸入“=LINEST(cBA數(shù)據(jù)區(qū)域，sBA數(shù)據(jù)區(qū)域，TRUE或FALSE，1)”公式，(shift+ctrl+enter)三鍵確認。一元線性回歸統(tǒng)計值返回格式見表2，而P值則可在某一單元格中輸入“=FDIST(F值，1，n-2)”得到。

表2 LINEST函數(shù)返回一元線性回歸統(tǒng)計值

注：括號中的數(shù)對即為統(tǒng)計值數(shù)組中的行、列號

表3 一元回歸模型線性比較

表4 一元回歸模型QAMS計算結(jié)果比較

注：Pt表示y預測與y實測的配對t檢驗P值；r表示y預測與y實測的相關(guān)系數(shù)；Q表示y預測與y實測的相似度；Q*表示y預測與y實測的改良相似度。

3.4 驗證實驗

表5 丹參滴注液樣品檢測數(shù)據(jù)

表6 一元回歸模型驗證實驗QAMS計算結(jié)果比較

4 討論

4.1 QAMS的準確性控制

QAMS的準確性主要依賴于一元回歸模型線性顯著、樣本數(shù)據(jù)無異常值、A成分測定處于“穩(wěn)態(tài)”(統(tǒng)計控制狀態(tài))、B等待測成分色譜峰的準確定位。

4.1.1 一元線性回歸模型的顯著性檢驗 線性回歸模型的顯著性檢驗，針對不同的目的可分別采用相關(guān)系數(shù)r檢驗、回歸系數(shù)b檢驗、整體模型檢驗。但對于類似y=a+bx一元回歸模型，3種檢驗效果具有等價性，即只要任選其一進行檢驗即可達到3種不同的檢驗目的[8]。本次研究采用對整體模型進行F檢驗，結(jié)果各方程的線性關(guān)系均非常顯著(P<0.01)。

對異常值的檢驗，通常有格羅布斯檢驗法、迪克遜檢驗法和t檢驗法等[9]。本次研究則采用t檢驗法，即檢驗回歸模型的y預測與y實測的絕對殘差值是否大于α水平臨界值ξ，若是，即可將其判定為異常值。對于y=a+bx回歸模型，假定x=x條件下的隨機變量y～N(a+bx，σ2)，ξ的計算公式[10]如下：

(1)

式中：tα(n-2)為自由度為(n-2)、置信水平(1-α)的t分布雙尾臨界值，可以通過查表或在Excel單元格中輸入“=TINV(α，n-2)”求得。

4.1.3 A成分的檢測結(jié)果“穩(wěn)態(tài)”檢驗 QAMS在求得fBA進行常規(guī)樣品檢測時，只對A對照品溶液附加檢測，故其他待測成分計算結(jié)果的準確性將完全依賴于A檢測結(jié)果的準確性，所以對A的檢測結(jié)果是否處于“穩(wěn)態(tài)”(受控狀態(tài))需及時加以關(guān)注和檢驗。方法可類似4.1.2對cA～sA或cBA～sBA數(shù)據(jù)建立(1-α)的殘差置信區(qū)間，也可以直接對fA進行檢驗，并對甄別的異常偏差進行分析、復測等處理。

4.1.4 B成分(丹參素鈉)色譜峰的定位 待測成分色譜峰的準確定位一般采用的是相對保留值RtBA=tB/tA、保留時間差ΔtBA=tB-tA[1-3]。經(jīng)統(tǒng)計，RtBA的RSD相對較小，故可選作B峰的主要定位依據(jù)。

4.2 相對校正因子評價方法

對于t檢驗法，似乎不能僅對原始數(shù)據(jù)線性回歸所得的y預測與y實測在一定的顯著性水平上有無統(tǒng)計學意義而決定是否可將fBA0或fBA1用于QAMS計算。對于驗證實驗或新的檢測數(shù)據(jù)，t檢驗法對y預測與y實測的差異統(tǒng)計學意義判定結(jié)果則與QAMS對fBA0或fBA1的穩(wěn)定性要求較為吻合。

Pt計算可以通過在Excel單元格中輸入“=TTEST(y實測數(shù)據(jù)區(qū)域，y預測數(shù)據(jù)區(qū)域，2，1)”求得。若Pt>0.05，即可判定y預測與y實測的差異無統(tǒng)計學意義(α=0.05)。

fBA0、fBA1均可用于QAMS計算，但fBA0則更顯簡單、合理，且可以直接通過fBA0計算供試品B成分濃度(cB=fBAO·fAr·sB或cB=fBAO·sBA·cA)。

4.3 QAMS在限量檢測中的應用

丹參滴注液中的等滲調(diào)節(jié)劑為葡萄糖，在高溫滅菌過程中較易分解產(chǎn)生5-羥甲基糠醛有害物(假設(shè)其為K成分)，所以質(zhì)量標準要求對K成分進行限度檢查：sK∶sKr<0.5，cKr=2.5 μg·mL-1。即要求供試品cK<1.25 μg·mL-1(折算成丹參滴注液樣品K成分濃度<12.5 μg·mL-1)。

由cKA=fKA·sKA可得sKA=cK/(fKA·cA)，所以，sKA<1.25/(fKA·cA)=2.27/cA即可認為符合限量規(guī)定(fKA≈0.55，RtKA≈0.40，ΔtKA≈16.08)。

經(jīng)統(tǒng)計546批丹參滴注液樣品K的檢測結(jié)果，平均值1.17 μg·mL-1，但大于5.0 μg·mL-1僅1批(最大值5.06 μg·mL-1)，相當于12.5 μg·mL-1規(guī)范限的40%。所以，據(jù)此可以設(shè)定安全系數(shù)極高的內(nèi)控標準：sKA<0.5/(fKA·cA)=0.91/cA。

一般情況下，企業(yè)生產(chǎn)的藥品均應按《中國藥典》(2010版)或國家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)批準的質(zhì)量標準所規(guī)定的方法進行檢測，但《中國藥典》(2010版)也并未完全否定采用其他的可行方法，只是要求應將該方法與規(guī)定的方法進行比較試驗，根據(jù)試驗結(jié)果掌握使用[13]。QAMS不僅可應用于中藥新藥的多成分質(zhì)量研究，也適用于企業(yè)對多成分中藥類上市產(chǎn)品，特別是對其中間產(chǎn)品進行準確、快速檢測，同時檢測成本也可大大降低。所以，QAMS是值得推廣應用的科學測定法。

[1] 王智民，錢忠直，張啟偉，等.一測多評法建立的技術(shù)指南[J].中國中藥雜志，2011，36(6)：657-658.

[2] 楊菲，王智民，張啟偉，等.“一測多評”法測定丹參酚酸類成分的含量[J].中國中藥雜志，2011，36(9)：2372-2379.

[3] 羅祖良，仇峰，韋日偉，等.相對校正因子在中藥多指標測定中的應用研究進展[J].中草藥，2012，43(7)：1448-1451.

[4] 國家食品藥品監(jiān)督管理局.國家中成藥標準匯編·中成藥地方標準上升國家標準部分[S].內(nèi)科·心系分冊.2002：455-459.

[5] 何兵，楊世艷，張燕.一測多評中待測成分校正和定位的新方法研究[J].藥學學報，2012，47(12):1653-1659.

[6] 魏鋒，程顯隆，馬玲云，等.藥品標準中替代對照品研究技術(shù)要求探討[J].中國藥品標準，2012，13(1)：12-15.

[7] 日花弘子.Excel函數(shù)與公式辭典[M].恒盛杰資訊，譯.北京：中國青年出版社，2009.

[8] 王天營.一元線性回歸分析中三種檢驗的等價性研究[J].統(tǒng)計與決策，2011，(7)：8-11.

[9] 張立偉.用數(shù)理統(tǒng)計的方法處理試驗數(shù)據(jù)的異常值[J].電線電纜，2005，(4)：46-48.

[10] 張圣勤，應慧芬.實用數(shù)學[M].下冊.上海：復旦大學出版社，2010：145-150.

[11] 王智民，高慧敏，付雪濤，等.“一測多評”法中藥質(zhì)量評價模式方法學研究[J].中國中藥雜志，2006，31(23)：1925-1928.

[12] 劉永鎖，孟慶華，蔣淑敏，等.相似系統(tǒng)理論用于中藥色譜指紋圖譜的相似度評價[J].色譜，2005，23(2)：158-163.

[13] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：XV.

TheFeasibilityResearchofQAMSofSalviamiltiorrhizaInjection

FANBugao*，DAITengshun

(ShanghaiTreefulPharmaceuticalCo.，Ltd.，Shanghai201506，China)

Objective：Assess the feasibility of QAMS using in analyzing the parameters ofSalviamiltiorrhizainjecting.MethodsSet up‘the optimal’ linear equation in one unknown of QMAS with retrospective study and Excel model approaches，check and compare the observable differences between predicated result(QAMS calculation result ypredict)and actual result(normal actual test yactual test)with relative deviation，t-test，correlation coefficient，similarity degree ect evaluation ways.ResultsThe condition of screening and getting rid of abnormal data，there is no statistically significant difference between the results of the content of Slavonic acid A sodium both ypredictand yactual testcalculated by ‘the optimal’ linear equation in one unknown slope as relative correction factorfSlavonic acid A sodium/protocatechualdehydesourced all kinds of methods，the average relative deviation are all less than 5%，which proves QMAS is exact and reliable to the content of Slavonic acid A sodium.ConclusionIt is reflected more convenient and low cost characteristics inSalviamiltiorrhizainjecting producing that QAMS use for analyzing the contents ofSalviamiltiorrhizainjecting，it is a inspection method that beyondSalviamiltiorrhizainjection’s quality standard rules also.

Quantitative analysis of multi-components by single marker(QAMS)；Relation correction factor(RCF)；Outlier test；Quality control；Excel；Salviamiltiorrhizainjection

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范步高，工程師，研究方向：藥品生產(chǎn)工藝、技術(shù)研發(fā)；E-mail：fanbugao@treeful.com.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.03.016

2013-05-06)