經(jīng)皮三叉神經(jīng)慢性電刺激對(duì)慢性癲癇大鼠海馬和皮層內(nèi)VGLUT1 表達(dá)的影響

賀慧艷，左 健，王倩倩，2，尹 娜，3，劉益民，王 玉

近年來(lái)，顱神經(jīng)電刺激治療癲癇和抑郁障礙等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病受到了很多學(xué)者的重視，其中三叉神經(jīng)電刺激(trigeminal nerve stimulation，TNS)對(duì)癲癇的治療作用已在癲癇患者和動(dòng)物模型中得到證實(shí)［1，2］。本研究小組前期通過(guò)TNS 預(yù)處理大鼠，發(fā)現(xiàn)其癲癇發(fā)作程度明顯低于對(duì)照組［3］，進(jìn)一步驗(yàn)證了TNS 具有顯著的抗癲癇作用，這為臨床癲癇的治療提供了一種新技術(shù)，但到目前為止尚無(wú)關(guān)于TNS抗癲癇作用機(jī)制的研究報(bào)道。興奮性和抑制性神經(jīng)傳遞的失衡是癲癇發(fā)作的核心機(jī)制［4］，興奮性氨基酸谷氨酸經(jīng)特異性囊泡型轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)到突觸囊泡內(nèi)，再經(jīng)胞吐作用釋放至突觸間隙，進(jìn)而引起突觸后神經(jīng)元發(fā)生相應(yīng)的改變［5］。本實(shí)驗(yàn)中，我們用囊泡型谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(vesicular glutamate transporter 1，VGLUT1)特異性標(biāo)記谷氨酸能神經(jīng)元突觸囊泡［6］，通過(guò)腹腔注射匹羅卡品(Pilo)誘導(dǎo)慢性癲癇大鼠模型，并對(duì)其進(jìn)行慢性周期性經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激，觀察經(jīng)皮三叉神經(jīng)慢性電刺激對(duì)慢性癲癇大鼠海馬和皮層內(nèi)VGLUT1 表達(dá)的影響，探討TNS 干預(yù)慢性癲癇形成的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用成年健康雄性SD大鼠150 只，普通級(jí)，體重200±20 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，置于自由飲水進(jìn)食、晝夜均衡、溫度20 ℃～25 ℃、濕度50%的環(huán)境中，喂養(yǎng)1 w以適應(yīng)環(huán)境。

1.2 癲癇模型的建立 隨機(jī)選用100 只大鼠腹腔注射(ip)東莨菪堿(1 mg/kg)以拮抗匹羅卡品的外周膽堿能反應(yīng)，30 min 后以匹羅卡品(360 mg/kg，美國(guó)Sigma 公司)腹腔注射誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)。大鼠行為學(xué)觀察根據(jù)我們修改后的Racine5級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［7］。Ⅰ級(jí):出現(xiàn)面部抽搐，鼻毛抽動(dòng)，前爪抓耳及咀嚼動(dòng)作;Ⅱ級(jí):出現(xiàn)點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)，一側(cè)前肢陣攣;Ⅲ級(jí):出現(xiàn)肢體陣攣和輕微的身體抽搐;Ⅳ級(jí):肢體陣攣，甩尾，牙關(guān)緊閉，全身抽搐;Ⅴ級(jí):全身陣攣，失去平衡，跌倒并全身僵直。本研究以發(fā)作達(dá)到Ⅲ級(jí)或Ⅲ級(jí)以上癇性發(fā)作且持續(xù)時(shí)間超過(guò)30 min為誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)成功的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于沒(méi)有達(dá)到該標(biāo)準(zhǔn)的大鼠，每30 min 追加匹羅卡品(30 mg/kg)直至達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。SE 大鼠自出現(xiàn)Ⅲ級(jí)或Ⅲ級(jí)以上癇性發(fā)作1 h 后，給予地西泮(10mg/kg，ip)以終止發(fā)作，隨后將SE 大鼠隨機(jī)分為模型組(Pilo 組，n=50)和經(jīng)皮三叉神經(jīng)慢性電刺激組(TNS 組，n=50)，正常對(duì)照組(n=50)給予同劑量的生理鹽水腹腔注射;各組又隨機(jī)分為24 h、72 h、7 d、14 d、28 d 5個(gè)亞組，每亞組10 只大鼠。

1.3 經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激 參照我們以前的方法［3］對(duì)TNS 組大鼠進(jìn)行經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激(北京博洋生物器械有限公司KD-2A 型經(jīng)皮電刺激儀)，簡(jiǎn)述如下:將經(jīng)10%水合氯醛(0.3 ml/kg，ip)麻醉后的大鼠俯臥固定，把兩個(gè)膜式電極對(duì)稱放置于三叉神經(jīng)分支-眶上神經(jīng)分布區(qū)域，即眼眶上方約1 cm、中內(nèi)1/3 交界處，外接經(jīng)皮電刺激儀;設(shè)置刺激參數(shù):頻率140 HZ、電流10 mA、脈寬0.5 ms、正相脈沖，每次刺激30 s 后間歇5 min，每天連續(xù)刺激2 h，持續(xù)刺激一個(gè)月。正常對(duì)照組和Pilo 組大鼠的各刺激參數(shù)均設(shè)置為0，其余操作同TNS 組;各組操作均在固定時(shí)間段進(jìn)行。

1.4 取材 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別在刺激結(jié)束后24 h、72 h、7 d、14 d、28 d 行斷頭取腦，每組每個(gè)時(shí)點(diǎn)大鼠數(shù)量為10 只，其中5 只用于免疫熒光雙標(biāo)，另5 只用于Western blot 半定量分析。用于免疫熒光雙標(biāo)的大鼠取材:10%水合氯醛(0.35 ml/kg，ip)麻醉后固定大鼠，開(kāi)胸經(jīng)左心室行升主動(dòng)脈插管，先以0.9%生理鹽水100 ml 快速灌注以沖凈腦內(nèi)血液，接著用4%多聚甲醛100 ml 先快后慢灌注固定全身，直至出現(xiàn)全身僵硬、尾巴僵直?？焖贁囝^取腦并于4%多聚甲醛中固定過(guò)夜，PBS 清洗后在30%蔗糖中脫水至組織塊沉底，以O(shè)CT 包埋后行冰凍切片，冠狀面連續(xù)切片以觀察海馬和皮層，冰凍切片厚約10 μm。用于Western blot 的大鼠取材:大鼠經(jīng)上述方法沖凈腦內(nèi)血液后，無(wú)需4%多聚甲醛灌注固定，快速斷頭取腦，迅速冰上分離皮層和海馬，二者分別儲(chǔ)存于相應(yīng)凍存管中，－80 ℃冰箱保存以備Western blot 半定量分析。

1.5 免疫熒光雙標(biāo)觀察皮層和海馬內(nèi)VGLUT1 的變化 將新鮮冰凍切片用4 ℃純丙酮中固定、0.3%Triton X-100 通透、5%BSA 封閉后加一抗:豚鼠抗VGLUT1(1∶1000，Millipore)和兔抗MAP2(1∶200，Millipore)，室溫下孵育1 h、4 ℃孵育過(guò)夜，PBS 漂后在避光條件下加入熒光標(biāo)記二抗即山羊抗豚鼠TRITC(1∶500，ImmunoReagents)和驢抗兔DyLight488(1∶200，EarthOx)，37 ℃避光孵育1 h，然后PBS 漂洗、抗熒光淬滅封片液封片。陰性對(duì)照分別以PBS 代替相應(yīng)一抗，其余操作同上。在熒光顯微鏡(Olympus IX71)下觀察，采用同一曝光度分別對(duì)每張切片進(jìn)行拍照，用Image Pro Plus6.0軟件進(jìn)行圖像分析，分別計(jì)數(shù)海馬和皮層平均每個(gè)神經(jīng)元胞體陽(yáng)性表達(dá)數(shù)、平均熒光強(qiáng)度。

1.6 Western blot 檢測(cè)皮層和海馬內(nèi)VGLUT1的表達(dá)情況 以蛋白裂解液(含1 mmol PMSF)提取組織總蛋白，經(jīng)BCA 法蛋白定量后加入2×SDS 上樣緩沖液，沸水浴10 min 變性，樣本(30 μg)經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，經(jīng)電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)印蛋白至PVDF 膜，用含5%(w/v)脫脂奶粉的洗脫緩沖液室溫封閉1 h，加入一抗豚鼠抗VGLUT1(1∶5000)和小鼠抗β-actin(1∶1000)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 緩沖液清洗后加入HRP 標(biāo)記的二抗(1∶10000)，37 ℃孵育1 h;TBST 緩沖液清洗、ECL 化學(xué)發(fā)光，曝光后顯影、定影。以β-actin 作為內(nèi)參照物，掃描并用Quantity one 4.62 軟件進(jìn)行圖像分析，測(cè)量相對(duì)光密度值(relative optical density，ROD)，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 海馬內(nèi)VGLUT1 的免疫熒光結(jié)果 正常對(duì)照組大鼠海馬內(nèi)VGLUT1 有廣泛表達(dá)，齒狀回門區(qū)和CA3區(qū)的表達(dá)量較多，錐體細(xì)胞層和齒狀回的顆粒細(xì)胞層表達(dá)量較少。Pilo 組大鼠海馬內(nèi)，VGLUT1 表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯增多，平均熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，尤以CA3區(qū)、齒狀回門區(qū)和內(nèi)分子層變化最為明顯，錐體細(xì)胞層和齒狀回的顆粒細(xì)胞層表達(dá)量也明顯增多，呈先上升后下降的趨勢(shì)，于72 h 左右達(dá)到高峰。以CA1區(qū)錐體細(xì)胞層VGLUT1的表達(dá)變化為例:Pilo 組與TNS 組較正常對(duì)照組在24 h、72 h、7 d、14 d、28 d 時(shí)VGLUT1 表達(dá)均明顯增多。與Pilo 組相比，TNS 組平均每個(gè)神經(jīng)元胞體VGLUT1 陽(yáng)性表達(dá)數(shù)及平均熒光強(qiáng)度在24 h 明顯增多(P＜0.01)，在72 h、7 d、14 d、28 d 均明顯減少(P＜0.05，P＜0.01)。

2.2 皮層內(nèi)VGLUT1 的免疫熒光結(jié)果 在正常對(duì)照組大鼠的皮層中VGLUT1 有基礎(chǔ)表達(dá)，表達(dá)量較少，主要集中在神經(jīng)元胞體和突起部位。Pilo組與TNS 組大鼠的皮層中VGLUT1 的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增多，均呈上升的趨勢(shì)，在72 h 左右達(dá)到高峰隨后逐漸下降。與Pilo 組相比，TNS 組皮層內(nèi)VGLUT1 的表達(dá)在24 h 明顯增多(P＜0.01)，在72 h、7 d、14 d、28 d 均明顯減少(P＜0.05，P＜0.01)。皮層內(nèi)平均每個(gè)神經(jīng)元胞體VGLUT1 陽(yáng)性表達(dá)情況在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)與上述結(jié)果并不完全一致，主要表現(xiàn)為在14 d 和28 d 時(shí)，TNS 組與Pilo 組相比差異仍有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，我們推斷這可能是由分布在非胞體部位的VGLUT1 的表達(dá)發(fā)生了變化所致。

2.3 海馬和皮層內(nèi)VGLUT1 的半定量分析(Western blot)VGLUT1 在海馬和皮層內(nèi)的Western blot 分析結(jié)果與免疫熒光相似，Pilo 組與TNS 組大鼠海馬和皮層內(nèi)VGLUT1 的相對(duì)表達(dá)量在24 h、72 h、7 d、14 d、28 d 時(shí)均高于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)正常對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.01)。與Pilo 組相比，TNS 組VGLUT1 相對(duì)表達(dá)量在24 h 明顯增多(P＜0.01)，在72 h、7 d、14 d、28 d 時(shí)明顯減少(P＜0.05，P＜0.01)。海馬內(nèi)VGLUT1 的相對(duì)表達(dá)量在28 d 時(shí)、皮層內(nèi)在14 d 和28 d 時(shí)均降至正常水平(P＞0.05)。

3 討論

腦內(nèi)興奮-抑制平衡是保證腦穩(wěn)態(tài)的重要條件，其復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制是通過(guò)各種神經(jīng)遞質(zhì)介導(dǎo)的，谷氨酸是哺乳動(dòng)物腦內(nèi)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，它經(jīng)VGLUT1 特異地轉(zhuǎn)運(yùn)入突觸囊泡，再經(jīng)胞吐作用釋放至突觸間隙，進(jìn)而引起突觸后神經(jīng)元發(fā)生相應(yīng)的改變［5，6］。VGLUT1 的表達(dá)水平通過(guò)影響谷氨酸能突觸囊泡的量子大小而影響谷氨酸在生理或病理狀態(tài)下的釋放進(jìn)而影響突觸的可塑性［7，8］。Boulland JL 等人［9］發(fā)現(xiàn)在匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇大鼠模型的慢性期，海馬CA1-CA3區(qū)VGLUT1 表達(dá)明顯增多，且含VGLUT1 的突觸終端也明顯增多。與此一致，我們發(fā)現(xiàn)慢性癲癇大鼠模型的海馬和皮層內(nèi)VGLUT1 的表達(dá)均較正常對(duì)照組顯著增加，我們推斷慢性癲癇大鼠模型海馬和皮層內(nèi)谷氨酸能神經(jīng)元興奮性突觸傳遞增強(qiáng)。

Navarro Mora G 等［10］發(fā)現(xiàn)，經(jīng)匹羅卡品誘導(dǎo)的大鼠即使在急性期沒(méi)有出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)后期也可觀察到癲癇自發(fā)性反復(fù)發(fā)作，這可能是匹羅卡品誘導(dǎo)一次癲癇發(fā)作后腦內(nèi)發(fā)生一系列的可塑性改變而致腦興奮性增高，最終發(fā)展成為具有自發(fā)性反復(fù)發(fā)作特點(diǎn)的慢性癲癇模型;在一次SE 后予以盡早的干預(yù)有可能改變這一發(fā)展過(guò)程從而起到減少癲癇發(fā)作的作用。三叉神經(jīng)的多種刺激形式均可通過(guò)丘腦激活包括顳葉皮層、海馬等感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)皮層在內(nèi)的廣泛大腦區(qū)域［11～13］，有報(bào)道高頻刺激視皮質(zhì)和海馬等處的神經(jīng)元能夠引起細(xì)胞興奮性增加，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)傳遞增強(qiáng)，使中間神經(jīng)元活性代償性增強(qiáng)，抑制性信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)，進(jìn)而使釋放至突觸間隙的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)增多;后者也可反作用于主體神經(jīng)元，抑制其興奮性，從而保持大腦自身的興奮性和抑制性信號(hào)傳導(dǎo)處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，即大腦的自身穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制，而長(zhǎng)期接受興奮性刺激產(chǎn)生的大腦自身穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的結(jié)果是神經(jīng)元興奮性降低的可塑性改變［14］。本文作者Wang 等人在培養(yǎng)的海馬腦片上慢性阻斷或減少興奮性沖動(dòng)傳導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)海馬興奮性的增高易于誘發(fā)癇性放電，且起抑制作用的中間神經(jīng)元的存活和其內(nèi)的GAD65/67 顯著減少［15］。本實(shí)驗(yàn)中大鼠致SE 后予以經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激處理一個(gè)月(這段時(shí)間正是慢性癲癇的形成過(guò)程)，我們發(fā)現(xiàn)TNS 刺激癲癇大鼠腦內(nèi)VGLUT1 的表達(dá)較假刺激癲癇大鼠在TNS 終止后短時(shí)間內(nèi)顯著增多，而在其后的較長(zhǎng)時(shí)間則顯著減少，提示谷氨酸能神經(jīng)元興奮性突觸傳遞先短時(shí)間內(nèi)顯著增強(qiáng)后較長(zhǎng)時(shí)間顯著減弱。我們推測(cè)經(jīng)皮三叉神經(jīng)慢性電刺激對(duì)癲癇形成過(guò)程中腦興奮性易感性的形成有干預(yù)作用，長(zhǎng)期慢性皮層和海馬激活可能使皮層和海馬產(chǎn)生一系列興奮性適應(yīng)性改變，從而提高了它們的興奮性閾值，即降低了它們的興奮性易感性。本研究小組在前期研究中發(fā)現(xiàn)經(jīng)皮TNS 預(yù)處理的大鼠癲癇發(fā)作程度較對(duì)照組明顯減輕，推測(cè)這與海馬內(nèi)GAD65/67 的表達(dá)量明顯增多有關(guān)［3］。因此，我們推斷經(jīng)皮三叉神經(jīng)慢性電刺激使腦的興奮性易感性降低、內(nèi)源性抑制機(jī)制增強(qiáng)，從而減少癲癇發(fā)作。此外，三叉神經(jīng)傳入纖維有部分終止于孤束核和藍(lán)斑核［1］，藍(lán)斑核在迷走神經(jīng)電刺激抗癲癇的機(jī)制中起著非常重要的作用，刺激藍(lán)斑核能明顯減少驚厥發(fā)作［16］，而毀損藍(lán)斑核則可促進(jìn)慢性癲癇的形成或加重癲癇的自發(fā)性反復(fù)發(fā)作［17］，因此，三叉神經(jīng)電刺激的抗癲癇作用是否與藍(lán)斑核的信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，在匹羅卡品誘導(dǎo)的慢性癲癇大鼠模型形成過(guò)程中，予以經(jīng)皮三叉神經(jīng)慢性電刺激處理降低了腦的興奮性易感性，其機(jī)制可能與腦內(nèi)VGLUT1 的表達(dá)先增多后減少有關(guān);關(guān)于三叉神經(jīng)慢性電刺激抗癲癇的確切機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

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