NLRP3 炎性小體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中的作用

宋麗敏 綜述，尚 游，吳 艷 審校

固有免疫是機(jī)體重要的防御屏障，含有核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和富含亮氨酸重復(fù)序列的受體(nucleotide-binding domain leucine-rich repeat-containing receptors，NLR)是一種模式識別受體，在機(jī)體受到微生物感染和內(nèi)源性損傷時，可以識別病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式并被激活，形成炎性小體，激活caspase-1，參與固有免疫應(yīng)答。

1 炎性小體

炎性小體是細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)復(fù)合體，主要存在于固有免疫細(xì)胞中。在外周主要是巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞;在中樞神經(jīng)系統(tǒng)則主要是小膠質(zhì)細(xì)胞。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種炎性小體復(fù)合物，典型組成包括NLR、接頭分子含有CARD 的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)和效應(yīng)蛋白caspase-1 前體(pro-caspase-1)(見圖1)。

NLRs 是胞漿內(nèi)的免疫受體家族，在人類細(xì)胞中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過20 種成員。NLRs N 端差異比較大，因此可以據(jù)此對NLR 進(jìn)行分類，已經(jīng)了解的N 端結(jié)構(gòu)域有4 種:N 端由pyrin domain(PYD)組成的稱為NLRP;N 端由caspase 募集結(jié)構(gòu)域(CARD)組成的稱為NLRC;N 端由BIR 樣結(jié)構(gòu)域組成的稱為NAIP 或BIRC;另一種是酸性反式激活結(jié)構(gòu)域。C 端是亮氨酸重復(fù)序列(leucine-rich repeats，LRR)，與配體識別有關(guān)，在NLR 自身調(diào)節(jié)方面也有作用。N 端與C 端之間的是核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding and oligomerization domain，NBT)，與自身寡聚化有關(guān)。ASC 由PYD 和CARD 組成，有些NLR 不能直接與pro-caspase 結(jié)合，ASC 可以起到銜接作用。刺激因素的作用下，NLRP3 寡聚化，通過PYD 結(jié)構(gòu)域與ASC 結(jié)合，ASC 再通過CARD 結(jié)構(gòu)域與pro-caspase-1 同源結(jié)合，從而形成多蛋白炎性小體。Pro-caspase-1 在胞漿組成性表達(dá)，炎性小體組裝形成以后，通過調(diào)節(jié)兩個或多個pro-caspase-1 單體的空間位置關(guān)系，啟動caspase-1 自身催化活性，使之切割為p20 和p10 兩個亞基，即成為成熟的有活性的caspase-1?；罨腸aspase-1 切割I(lǐng)L-1β 的前體pro-IL-1β，使之成熟并分泌到細(xì)胞外發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。NLRP3 與ASC 和pro-caspase-1 組裝形成的NLRP3 炎性小體是本文的主要討論對象。

2 NLRP3 炎性小體

2.1 NLRP3 炎性小體的激活物 有活性的NLRP3 炎性小體的產(chǎn)生需要兩個信號:信號一是炎性刺激通過NF-κB依賴性信號通路，引起NLRP3 表達(dá);信號二是NLRP3 激活。NLRP3 可以由外源性微生物及其毒素和內(nèi)源性危險信號激活，它們的理化特性各不相同。外源性的包括金黃色葡萄球菌及其溶血毒素［1］、李斯特單核桿菌、結(jié)核分枝桿菌［2］、肺炎鏈球菌［3］、腺病毒等。內(nèi)源性的包括三磷酸腺苷(ATP)、石棉、二氧化硅、尿酸鹽、7-溴靛玉紅-3、神經(jīng)酰胺、脂質(zhì)體、氧化低密度脂蛋白［4］等。

2.2 NLRP3 炎性小體的激活機(jī)制 沒有內(nèi)外源性刺激因素作用時，NLRP3 的LRR 結(jié)構(gòu)域通過與泛素連接酶相關(guān)蛋白和分子伴侶熱休克蛋白90 結(jié)合，處于自身抑制狀態(tài)，但是易于被激活［1］。NLRP3 炎性小體活化的確切機(jī)制目前還沒有完全明確，目前，被大家較多提及的理論有以下這些(見圖2)。

圖1 炎性小體的基本組成

圖2 NLRP3 炎性小體的激活途徑:(1)鉀離子外流;(2)ROS產(chǎn)生;(3)吞噬溶酶體內(nèi)容物釋放;(4)鈣離子動員

2.2.1 鉀離子外流 許多刺激物如微生物的成孔毒素、結(jié)晶體，能在細(xì)胞膜上形成孔道，引起鉀離子外流［5］。細(xì)胞死亡、腦缺血等因素都會引起ATP 釋放到胞外，ATP 激活胞膜的P2X7 受體，打開該配體門控的離子通道，使鉀離子外流。P2X7 受體的激活還可以引起細(xì)胞膜上名為泛連接蛋白的大孔道開放，能轉(zhuǎn)運(yùn)900 道爾頓大小的分子穿過細(xì)胞膜，包括鉀離子［1，6］。在培養(yǎng)基中加入高濃度氯化鉀，抑制鉀離子外流，發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌等誘導(dǎo)的IL-1β 的產(chǎn)生明顯減少［2］。近來，ATP 釋放和嘌呤受體信號在NLRP3 炎性小體活化中的作用機(jī)制已經(jīng)得到較為清楚的闡釋。

2.2.2 活性氧 活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species，ROS)與氧化應(yīng)激有關(guān)，細(xì)胞接受刺激時，氧化酶組裝活化，線粒體內(nèi)ROS 合成［7］，是NLRP3 炎性體活化的重要上游信號。胞漿內(nèi)硫氧還蛋白結(jié)合蛋白(TXNIP)與硫氧還蛋白(TRX)結(jié)合，炎性小體的激活物使ROS 產(chǎn)生增加，TXNIP 與TRX 解離，TXNIP 構(gòu)象改變，與NLRP3 相互作用，引起炎性小體活化［8］。抑制ROS 產(chǎn)生的藥物或者線粒體ROS 清除劑都能減少IL-1β 產(chǎn)生［9］。但是，也有研究者認(rèn)為，ROS 通過NF-κB 途徑上調(diào)NLRP3 和pro-IL-1β 的表達(dá)，而不是直接活化NLRP3 炎性小體。為了特異性地研究ROS 是否在pro-IL-1β 合成以后對NLRP3 炎性小體有影響，在脂質(zhì)體激活NLRP3 炎性小體模型中，延長脂多糖提前處理的時間，以保證NF-κB 途徑的充分活化，再加入抑制ROS 產(chǎn)生的藥物，結(jié)果同樣證實ROS 可以活化NLRP3 炎性小體［4］。

2.2.3 溶酶體內(nèi)容物釋放 溶酶體內(nèi)有多種蛋白水解酶，包括組織蛋白酶家族，其破壞后這些蛋白水解酶釋放入胞漿，可以引起損傷作用，組織蛋白酶B(Cathepsin B)與阿爾茲海默病(Alzheimer disease，AD)有關(guān)。Aβ 被小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬后，溶酶體腫脹、不穩(wěn)定、功能失常，Cathepsin B 釋放入胞漿，引起NLRP3 炎性小體活化，Cathepsin B 抑制劑使IL-1β釋放明顯減少［10］。血清淀粉樣蛋白A、7-溴靛玉紅-3、金黃色葡萄球菌引起NLRP3 炎性小體活化時也是如此。結(jié)核分枝桿菌激活NLRP3 炎性小體時，除了Cathepsin B，組織蛋白酶L 也發(fā)揮作用［5］。P2X7 受體激活也可引起溶酶體內(nèi)容物釋放。肺炎鏈球菌引起ATP 釋放到胞外，繼而溶酶體組織蛋白酶B 釋放，NLRP3 炎性小體激活，但是沒有巨噬細(xì)胞吞噬和溶酶體破壞的參與［3］。

2.2.4 其他 鈣離子動員在NLRP3 炎性小體活化中的作用也逐漸被人發(fā)現(xiàn)。細(xì)胞接受刺激時發(fā)生鈣離子動員，鉀離子外流引起漿膜極化，鈣離子內(nèi)流，吞噬溶酶體破裂也可以引起其內(nèi)的鈣離子進(jìn)入胞漿。一方面，胞漿內(nèi)鈣超載促進(jìn)線粒體損傷，產(chǎn)生更多ROS，進(jìn)一步活化NLRP3;另一方面，單核巨噬細(xì)胞漿膜上表達(dá)瞬時受體電位通道2，是一種非選擇性陽離子通道，ROS 在胞漿的聚集可以引起鈣離子通過此通道內(nèi)流。該通道基因敲除小鼠巨噬細(xì)胞中，鈣離子內(nèi)流減少，IL-1β 釋放也減少，提示經(jīng)此途徑引起的鈣離子內(nèi)流與NLRP3 炎性小體活化有關(guān)［11］。抑制鈣離子動員可以抑制NLRP3 炎性小體活化。

以上這些學(xué)說都有待闡明，越來越多人接受的觀點(diǎn)是，NLRP3 炎性小體的激活是個復(fù)雜的、多種機(jī)制相互作用、相互影響的過程。

2.3 NLRP3 炎性小體的活性調(diào)節(jié)

2.3.1 ASC 調(diào)節(jié) 細(xì)胞未接受刺激時，ASC 位于胞核，炎性刺激使ASC 轉(zhuǎn)位到胞漿才能與NLRs 和pro-caspase-1 結(jié)合成為聚合體，進(jìn)而引起IL-1β 處理和分泌。ASC 有3 種新的亞型:ASC-b、ASC-c 和ASC-d，它們的功能各不相同。只有活化狀態(tài)的ASC 和ASC-b 能與NLRP3 和caspase-1 共定位，激活NLRP3 炎性小體。ASC-c 和ASC-d 作為抑制亞基，前者只與caspase-1 共定位，后者既不與NLRP3 也不與caspase-1共定位，都不發(fā)揮活化作用［12］。

2.3.2 特殊蛋白調(diào)節(jié) COPs(CARD-only proteins)是只含有CARD 結(jié)構(gòu)域的蛋白家族，目前發(fā)現(xiàn)的成員包括Iceberg、COP1/Pseudo-ICE、INCA、caspase-12s、和Nod2-S。它們與pro-caspase-1 的CARD 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使后者不能與ASC 結(jié)合，不能形成炎性小體。POPs(PYD-only proteins)是只含有PYD 結(jié)構(gòu)域的蛋白家族，較多提及的是POP1 和POP2，與ASC 或者NLRP 的PYD 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，阻止炎性小體形成;還可以阻止NF-κB 的激活，從轉(zhuǎn)錄水平抑制NLRP3 表達(dá)。一些病毒株可以通過自身的病毒POPs 抑制炎性小體活化［14］。

2.3.3 其他調(diào)節(jié) 細(xì)胞間相互作用也可以調(diào)控炎性小體的激活。小鼠CD4+效應(yīng)T 細(xì)胞和記憶B 細(xì)胞能夠抑制caspase-1 活化和IL-1β 成熟，主要是針對NLRP3 和NLRP1，通過T 細(xì)胞表達(dá)的腫瘤壞死因子家族配體實現(xiàn)［13］。細(xì)胞自噬對NLRP3 炎性小體活化也有調(diào)節(jié)作用。自噬過程調(diào)控長壽命蛋白質(zhì)、蛋白多聚物和入侵微生物的降解，缺乏自噬功能的細(xì)胞，NLRP3 炎性小體更易被激活［9，14］。

3 NLRP3 炎性小體與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥

小膠質(zhì)細(xì)胞是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)定居的免疫細(xì)胞，其活化可以引起炎癥反應(yīng)。正常情況下，IL-1β 在腦中有低水平表達(dá)，NLRP3 炎性小體激活使IL-1β 大量成熟并分泌到細(xì)胞外，引起炎癥反應(yīng)，激活一些病理生理過程。多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)與NLRP3 炎性小體的活化有關(guān)。

3.1 NLRP3 炎性小體與神經(jīng)退行性疾病 細(xì)胞外Aβ聚集形成的斑塊在AD 的發(fā)生發(fā)展中有重要作用，小膠質(zhì)細(xì)胞募集在Aβ 斑塊周圍，發(fā)揮吞噬作用并被活化，IL-1β 是針對Aβ 的炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞因子，AD 患者腦脊液中IL-1β含量明顯升高。Aβ 被小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬后激活NLRP3 炎性小體，M2 型標(biāo)記物Arg-1、IL-4 表達(dá)減少，M1 型標(biāo)記物NOS2等表達(dá)增多，說明小膠質(zhì)細(xì)胞從M2 型轉(zhuǎn)變?yōu)镸1 型［15］。產(chǎn)生的IL-1β 和其他的促炎性細(xì)胞因子、神經(jīng)毒性因子，對周圍的神經(jīng)元等造成損傷，進(jìn)一步放大Aβ 的致病作用［10］。同時，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞清除Aβ 的能力下降，引起Aβ 斑塊沉積增加。

多發(fā)性硬化癥(MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性炎性脫髓鞘疾病，MS 斑塊和MS 患者血液中caspase-1 含量都有明顯增高，腦脊液中IL-1β 明顯增多，Nlrp3 基因變異的患者體內(nèi)檢測到MS 樣損傷。實驗性自身免疫性腦脊髓炎是MS的動物模型，該模型脫髓鞘病灶內(nèi)有小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和聚集，而且早于臨床癥狀出現(xiàn)，NLRP3 炎性小體活化可以加重病情進(jìn)展［16］。

3.2 NLRP3 炎性小體與感染性疾病 腦膿腫的主要病因是金黃色葡萄球菌感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)，感染后數(shù)小時內(nèi)就有小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，以及多種促炎性因子的快速產(chǎn)生，引起廣泛的炎癥和壞死。IL-1β 是金葡菌激活小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的主要細(xì)胞因子，部分是通過激活NLRP3 炎性小體產(chǎn)生的，還有一部分是通過非炎性小體途徑產(chǎn)生的。NLRP3 炎性小體的激活有賴于活細(xì)菌產(chǎn)生的ATP 和α-、γ-溶血毒素，cathepsin B 在此過程中也發(fā)揮作用［1］。

腦膜炎是肺炎鏈球菌感染性疾病中預(yù)后最差的，死亡率達(dá)到15%～30%，caspase-1 是該病炎癥反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)物質(zhì)。NLRP3 和ASC 表達(dá)缺失可以減低小鼠肺炎球菌性腦膜炎的臨床評分、組織損傷程度和腦的炎癥，用IL-1β 抑制劑可以觀察到ASC 和NLRP3 依賴性的病理學(xué)緩解［3］。

小膠質(zhì)細(xì)胞是結(jié)核桿菌在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的主要靶細(xì)胞，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞與其他細(xì)胞共同作用，釋放多種促炎因子和趨化因子，結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液中IL-1β 有明顯增高。用結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞，獲得條件培養(yǎng)基，再用此處理小膠質(zhì)細(xì)胞，最后經(jīng)結(jié)核桿菌感染，可以發(fā)現(xiàn)明顯的caspase-1 活化和IL-1β 釋放，并且發(fā)現(xiàn)IL-1β 的成熟是NLRP3、ASC 和ROS 依賴性的。地塞米松治療結(jié)核性腦膜炎的作用，部分是通過抑制ROS，從而抑制NLRP3 炎性小體激活來實現(xiàn)的［2］。

4 總結(jié)

NLRP3 炎性小體是近年來的研究熱點(diǎn)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種內(nèi)源性和外源性物質(zhì)可以發(fā)揮激活作用，有關(guān)其活化和調(diào)節(jié)的分子機(jī)制也在逐漸闡明，NLRP3 炎性小體的激活引起IL-1β 成熟，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有免疫中發(fā)揮重要作用。特異性抑制NLRP3 炎性小體的活化途徑，是相關(guān)疾病新的治療靶點(diǎn)。

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