枯草芽孢桿菌對蠅蛆飼養(yǎng)效果及抗菌蛋白的影響

■雷土青 鄧江華 李建文 楊志強(qiáng)

(武漢輕工大學(xué)湖北省飼料工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430023)

蠅蛆具有繁殖速度快、營養(yǎng)價(jià)值高、飼養(yǎng)周期短等特點(diǎn)，體內(nèi)還含有大量活性蛋白，是一種具有巨大開發(fā)和應(yīng)用潛力的昆蟲蛋白資源之一。蠅蛆食性雜，且能在充滿細(xì)菌的惡劣環(huán)境下生長。用畜禽糞飼養(yǎng)有非常好的效果，畜禽糞在我國產(chǎn)量非常大，可大大降低生產(chǎn)成本。研究表明，蠅蛆體內(nèi)含有抗菌蛋白、抗菌肽、殼聚糖等抗菌活性物質(zhì)，而且熱穩(wěn)定性高，具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景。Schmidtmann（1992）等研究表明，蠅蛆在完全無菌的環(huán)境下不能完成正常的生長發(fā)育歷程，而細(xì)菌能為蠅蛆提供大量營養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸、脂肪酸、維生素等，促進(jìn)蠅蛆生長發(fā)育。蠅蛆在未誘導(dǎo)的情況下能產(chǎn)生抗菌肽等活性物質(zhì)，用細(xì)菌針刺法和飼喂法都能不同程度地提高蠅蛆體內(nèi)抗菌蛋白/肽的含量及其殺菌活性。因此，飼料中細(xì)菌含量能影響蠅蛆生長發(fā)育及其體內(nèi)抗菌活性物質(zhì)的含量。本文通過在麥麩中添加枯草芽孢桿菌，以研究其對蠅蛆飼養(yǎng)效果、抗菌蛋白含量及其抗菌活性的影響，為在衛(wèi)生飼料飼養(yǎng)條件下蠅蛆活性蛋白/肽的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 飼料

所用飼料為市售麥麩。

1.1.2 菌種

枯草芽孢桿菌、大腸桿菌K88由湖北省飼料工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 主要試劑

苯甲基磺酰氟（上海源葉生物科技有限公司），β-巰基乙醇（上海誠心化工有限公司），LB培養(yǎng)基（OXID公司），考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒（南京建成生物工程有限公司），硫酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、NaCl等試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要儀器

高速組織搗碎機(jī)（JJ-2）(常州國華電器有限公司)，大容量離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、恒溫生化培養(yǎng)箱、電子分析天平（AR-2140奧豪斯儀器（上海）有限公司）、恒溫烘箱、微量凱氏定氮儀、索氏提取器、箱式高溫電爐等。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以麥麩為基礎(chǔ)飼糧，分別添加枯草芽孢桿菌菌粉0（對照組）、0.3%、0.6%，加水混勻，并保溫24 h后，按一定飼養(yǎng)密度投入1日齡幼蛆，飼養(yǎng)至4日齡。

1.2.2 生長指標(biāo)測定和計(jì)算公式

收集4日齡蠅蛆和殘料，鮮蛆風(fēng)干表層水分后稱重，殘料稱重，隨機(jī)取約100頭鮮蛆，計(jì)算平均單頭蛆重。鮮蛆和殘料分別取樣，在(105±2)℃恒溫烘箱中烘干至恒重，在干燥器中冷卻后，稱重，分別計(jì)算蠅蛆干物質(zhì)得率和殘料干重。

平均單頭蛆重（mg）=鮮蛆樣重（g）/鮮蛆數(shù)（頭）×1 000；

蠅蛆干物質(zhì)得率（%）=樣蛆干重/樣蛆鮮重×100；

凈料重比=原料重/（鮮蛆總重-1日齡幼蛆重）；

飼料凈消耗量（%）=（原料絕干物料重-殘料重×殘料干重）/原料絕干物料總重×100。

1.2.3 蠅蛆和物料營養(yǎng)成分

將蠅蛆、殘料及原料絕干樣用微量凱氏定氮法測粗蛋白含量，用索氏提取法測粗脂肪含量，用550℃高溫灼燒法測粗灰分含量。

1.2.4 組織勻漿法提取抗菌蛋白

稱取一定量4日齡鮮蛆，按液(ml)∶固(g)比為3∶1加入4℃下預(yù)冷的提取緩沖液（pH值7.0，50 mmol/l PBS，35 μg/ml苯甲基磺酰氟，0.2%巰基乙醇），充分勻漿，于4 ℃、4 000 r/min離心30 min，過400目紗布，取濾液即為蠅蛆抗菌蛋白粗提液Y。粗提液Y于4℃、12 000 r/min離心30 min，過400目紗布，濾液即為粗提液G，于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 粗提液總蛋白濃度差異檢測

用Bradford法檢測粗提液Y和G的總蛋白濃度（mg/ml）。

1.2.6 粗提液抗菌活性檢測

用抑菌圈法檢測抗菌活性，指示菌為大腸桿菌K88。LB液體培養(yǎng)基接種大腸桿菌，搖床培養(yǎng)活化細(xì)菌至OD600≈1.0，將活化后的菌液按1∶1 000的比例加入到LB固體培養(yǎng)基中，搖勻，倒平板。把直徑(d)為6 mm的滅菌濾紙片均勻放在培養(yǎng)基表面，每平皿7片，每片點(diǎn)樣20 μl，靜置30 min，于37℃恒溫生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)10～12 h，測抑菌圈。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan's法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌對蠅蛆生長性能和物料消耗量的影響（見表1）

表1 枯草芽孢桿菌對蠅蛆生長性能和物料消耗量的影響(n=3)

如表1所示，0.3%組蠅蛆平均單頭蛆重最大，試驗(yàn)組蠅蛆干物質(zhì)得率平均提高1%～2%，料重比明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，枯草芽孢桿菌對飼料凈消耗量沒有明顯的影響(P＞0.05)。結(jié)果表明，麥麩中添加枯草芽孢桿菌能明顯提高蠅蛆生產(chǎn)效率。

2.2 枯草芽孢桿菌對蠅蛆和物料營養(yǎng)成分的影響（見表2）

表2 枯草芽孢桿菌對蠅蛆和物料營養(yǎng)成分的影響（%，n=3）

如表2，麥麩中添加枯草芽孢桿菌，蠅蛆粗脂肪含量提高2%～5%（P＜0.01），添加量越大，脂肪含量越高。試驗(yàn)組蠅蛆粗蛋白質(zhì)和粗灰分含量均低于對照組，但沒有明顯的差異（P＞0.05）。各組殘料的粗蛋白質(zhì)均明顯低于原料（P＜0.05或P＜0.01），粗脂肪的消耗量各組沒有明顯差異，而試驗(yàn)組極顯著低于原料（P＜0.01），營養(yǎng)物質(zhì)的消耗導(dǎo)致粗灰分含量明顯增多（P＜0.01）。

2.3 枯草芽孢桿菌對蠅蛆粗提液總蛋白濃度差異的影響（見表3）

表3 枯草芽孢桿菌對粗提液總蛋白質(zhì)濃度的影響(mg/ml，n=3)

本試驗(yàn)采用組織勻漿法提取蠅蛆抗菌蛋白，由表3可知，試驗(yàn)組粗提液Y的總蛋白質(zhì)濃度有所提高（P＞0.05），0.3%組粗提液G中總蛋白質(zhì)濃度比對照組提高了2.25個百分點(diǎn)（P＜0.05），0.3%和0.6%組之間粗提液總蛋白濃度沒有明顯差異（P＞0.05）。

2.4 蠅蛆粗提液抗菌活性差異（見圖1～圖2）

圖1 枯草芽孢桿菌組

圖2 對照組

由圖1及圖2可知，表明試驗(yàn)組抗菌活性要比對照組略高，但是沒有明顯的差別，與粗提液Y的總蛋白濃度差異相符。圖1中各個紙片抑菌圈大小和透明程度相當(dāng)，表明0.3%和0.6%組之間沒有明顯的差異。

3 討論

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，麥麩用枯草芽孢桿菌發(fā)酵后飼養(yǎng)蠅蛆，能明顯提高蠅蛆生長發(fā)育速度和干物質(zhì)沉積率，對飼料凈消耗量和營養(yǎng)成分的消耗比重差異不明顯（P＞0.05），可能是枯草芽孢桿菌本身成為蠅蛆的食物促進(jìn)蠅蛆生長；枯草芽孢桿菌本身能分泌大量酶類物質(zhì)，改善飼料品質(zhì)，產(chǎn)生更多的氨基酸、脂肪酸、維生素、可溶性還原糖等，這些物質(zhì)有利于蠅蛆消化吸收。

采用組織勻漿法得到的蠅蛆抗菌蛋白粗提液，試驗(yàn)組粗提液Y的抗菌活性有所提高，但沒有明顯的差異，可能是枯草芽孢桿菌發(fā)酵后，飼料中細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)單一，以枯草芽孢桿菌為主，而這種細(xì)菌對蠅蛆抗菌蛋白誘導(dǎo)能力不如大腸桿菌等G-菌。

4 結(jié)論

麥麩中添加枯草芽孢桿菌，發(fā)酵后，能明顯提高蠅蛆生產(chǎn)效率，對提高蠅蛆抗菌蛋白等活性物質(zhì)含量和抗菌活性有一定的促進(jìn)作用。

（參考文獻(xiàn)17篇，刊略，需者可函索）