響應(yīng)面法優(yōu)化芽孢桿菌BY-3產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基

■孟凡旭 馬 麗 楊偉平 姬生躍 辛海云 曹斌云

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌712100）

近年來(lái)，隨著世界人口的急劇增加和畜牧業(yè)的持續(xù)快速增長(zhǎng)，使得糧食供需矛盾愈加突出。纖維素（cellulose）是地球上分布最廣、含量最豐富、有巨大潛力的可持續(xù)能源物質(zhì)和可再生資源[1]。在我國(guó)，每年生產(chǎn)作物秸稈7億多噸，除了反芻動(dòng)物可以利用瘤胃微生物降解轉(zhuǎn)化部分外，大部分不但不能被動(dòng)物消化利用，反而影響其對(duì)蛋白質(zhì)、淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。纖維素酶（cellulase）是能水解纖維素β-1，4糖苷鍵，使纖維素降解生成纖維二糖和葡萄糖的一類(lèi)酶的總稱[2]，在動(dòng)物飼料中添加纖維素酶，可以改善飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，提高動(dòng)物對(duì)纖維素類(lèi)飼料的利用效率。因此，合理利用農(nóng)作物資源、提高微生物產(chǎn)纖維素酶的產(chǎn)量對(duì)于改善飼料利用效率，解決糧食危機(jī)、環(huán)境污染等具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。當(dāng)前，工業(yè)和實(shí)驗(yàn)室用纖維素酶的主要菌源為真菌，但是由于細(xì)菌易培養(yǎng)、生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)酶周期短且所產(chǎn)酶具有良好的穩(wěn)定性(熱、pH值)[3]等優(yōu)點(diǎn)，成為工業(yè)酶最重要的菌源之一。一些嗜熱的纖維素酶生產(chǎn)菌株已經(jīng)被分離出來(lái)[4-5]。微生物發(fā)酵培養(yǎng)基是影響纖維素酶產(chǎn)量和生產(chǎn)成本的重要因素[6]，很多研究者對(duì)優(yōu)化產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了研究，但是大多基于單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，無(wú)法考察培養(yǎng)基中各組分間的交互作用，也就不能提供培養(yǎng)基中各組分的最佳組合[7]。響應(yīng)面分析（RSM）結(jié)合了數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)研究方法，通過(guò)回歸分析，擬合因素與試驗(yàn)結(jié)果（響應(yīng)值）之間的函數(shù)關(guān)系，并對(duì)多項(xiàng)式中各因素的水平及交互作用對(duì)響應(yīng)值的作用進(jìn)行優(yōu)化和評(píng)價(jià)，可以用最少的試驗(yàn)次數(shù)有效確定多因子系統(tǒng)的最佳條件[8-9]。該方法已廣泛應(yīng)用于各類(lèi)發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件等的優(yōu)化實(shí)踐中[10-13]。然而，采用單因素試驗(yàn)與RSM結(jié)合的優(yōu)化方法，系統(tǒng)的對(duì)微生物產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行設(shè)計(jì)、優(yōu)化的報(bào)道較少。嗜熱芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BY-3是本實(shí)驗(yàn)室從成年藏豬的盲腸內(nèi)容物中分離篩選出的具有降解纖維素能力的菌株。本研究旨在①降低發(fā)酵培養(yǎng)基的生產(chǎn)成本。通過(guò)單因素優(yōu)化試驗(yàn)從廉價(jià)的農(nóng)業(yè)廢棄物和工業(yè)副產(chǎn)品中篩選出經(jīng)濟(jì)高效的碳源和氮源；②提高纖維素酶的產(chǎn)量。分別利用Plackett Burman（PB）設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)和中心組合設(shè)計(jì)（CCD）對(duì)該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，得到最高效的產(chǎn)酶培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

B.subtilisBY-3是由本實(shí)驗(yàn)室從藏豬盲腸內(nèi)容物中分離、篩選所得，現(xiàn)保藏于中國(guó)武漢典型培養(yǎng)物保藏中心（保藏號(hào)：CCTCC No.M2013382.）。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（g/l）：蛋白胨10、酵母粉 5、NaCl 5、玉米粉5。

結(jié)合文獻(xiàn)[14-15]，產(chǎn)酶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.3 g/l，K2HPO4·3H2O 1.5 g/l，NaCl 5 g/l，酵母粉0.5 g/l，蛋白胨20 g/l，羧甲基纖維素鈉（CMC）20 g/l，CaCl2·2H2O 0.1 g/l，吐溫80 0.1%(v/v)。

試驗(yàn)所用蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉購(gòu)自O(shè)XOID公司；CMC購(gòu)自Sigma公司，其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。以上所有培養(yǎng)基均于121℃高壓蒸汽滅菌20 min，試驗(yàn)所用不溶解的纖維素類(lèi)物質(zhì)先在60℃烘箱中干燥48 h，再經(jīng)60目篩子過(guò)濾后使用。

1.1.3 主要儀器

NanoDrop公司的ND-1000型紫外分光光度計(jì)、Beckman CouLter Allegra64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、日本TOMY公司SX-500高壓滅菌鍋、HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱、方舟科技E-331/S-3+酸度計(jì)等。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵條件

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的前期研究，本研究所有發(fā)酵試驗(yàn)皆在如下發(fā)酵條件下進(jìn)行：裝劑量50 ml/250 ml、接種量3%、發(fā)酵溫度42℃、發(fā)酵時(shí)間24 h、培養(yǎng)基初始pH值6.5±0.1。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)

自斜面挑取1單一菌落接種于裝有50 ml種子培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，37℃ 、220 r/min下振蕩培養(yǎng)12 h，使菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。隨后，將種子液以3%的接種量接種于相應(yīng)的發(fā)酵培養(yǎng)基中（依照試驗(yàn)設(shè)計(jì)），每批次的發(fā)酵都在裝有50 ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中進(jìn)行。

1.2.3 纖維素酶活性測(cè)定方法

粗酶液的的制備：經(jīng)24 h深層發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)液，在4℃冷凍低溫離心機(jī)中以10 000 r/min離心30 min，除去菌體及培養(yǎng)基殘?jiān)?，收集上清液即為粗酶液?/p>

羧甲基纖維素酶（CMCase）活性測(cè)定：采用IUPAC標(biāo)準(zhǔn)化方法[16]，依據(jù)DNS（3,5-二硝基水楊酸）比色法原理繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[17]。簡(jiǎn)而言之，吸取1 ml含有1%（w/v）CMC底物的50 mmol醋酸鹽緩沖液(pH值5.5)至25 ml的刻度試管中，再加入1 ml經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的粗酶液，振蕩混勻后在50℃保溫30 min。然后加入3 ml DNS試劑終止酶解反應(yīng)，沸水浴加熱5 min，流水冷卻至室溫，加水至25 ml后混勻。于540 nm處測(cè)定吸光度，加熱失活的酶液作為空白對(duì)照，測(cè)得OD值后查閱葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得從底物CMC上生成還原糖的量。本研究將在上述條件下每分鐘催化底物生成1 μmol還原糖所需酶量定義為一個(gè)酶活力單位，用U/ml表示。

1.2.4 培養(yǎng)基中最優(yōu)碳源和氮源的篩選

以纖維素酶CMCase活性為衡量標(biāo)準(zhǔn)，分別以葡萄糖、大麥秸稈、小麥秸稈、玉米秸稈、可溶性淀粉、麥麩以及CMC作為產(chǎn)酶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的單一碳源。將種子液按3%的接種量接種，42℃、220 r/min下深層發(fā)酵24 h后進(jìn)行CMCase活性測(cè)定。在確定了最優(yōu)碳源的基礎(chǔ)之上，分別以硫酸銨、尿素、豆粕、酵母粉以及蛋白胨作為培養(yǎng)基中的單一氮源進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，在相同的發(fā)酵條件下深層發(fā)酵24 h后進(jìn)行CMCase活性測(cè)定。

1.2.5 PB篩選試驗(yàn)

PB設(shè)計(jì)是一種2水平的篩選試驗(yàn)方法，可以用最少的試驗(yàn)次數(shù)從眾多的考察因素中高效地篩選出顯著影響響應(yīng)值的因素以供進(jìn)一步研究[18]。依據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)要素的基本需求，本次試驗(yàn)選取碳源、氮源和6個(gè)潛在影響B(tài)Y-3纖維素酶產(chǎn)量的培養(yǎng)基組分（金屬離子、營(yíng)養(yǎng)素等）作為變量，同時(shí)設(shè)立3個(gè)虛擬變量減少系統(tǒng)誤差，以CMCase活性作為響應(yīng)值。通過(guò)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析獲得一個(gè)多元一次回歸方程：

式中：Y——預(yù)測(cè)響應(yīng)值；

β0——模型常量；

βi——一次系數(shù)；

Xi——獨(dú)立變量編碼值。

1.2.6 最陡爬坡試驗(yàn)

為了快速逼近最大的響應(yīng)區(qū)域，選取顯著影響纖維素酶酶活的因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。依據(jù)PB篩選試驗(yàn)結(jié)果中多元一次方程回歸系數(shù)的正負(fù)和大小決定各顯著因素的最陡上升路徑，其它因素保持在PB試驗(yàn)的較低水平。

1.2.7 CCD和響應(yīng)面分析

CCD是一種常見(jiàn)的響應(yīng)面分析方法，不僅可以減少試驗(yàn)次數(shù)，而且可以考察各因素間的交互作用。根據(jù)PB設(shè)計(jì)和最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)2因素（NaCl、玉米秸稈）5水平（-1.414、-1、0、+1和+1.414）的CCD方法來(lái)確定各顯著因素的最優(yōu)水平。為了預(yù)測(cè)最高CMCase活性的因素組合，根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)得到一個(gè)以酶活為響應(yīng)值的多元二次方程模型：

式中：Y——預(yù)測(cè)響應(yīng)值；

β0——模型常量；

Xi、Xj——獨(dú)立變量編碼值；

βi——一次系數(shù)；

βii——二次系數(shù)；

βij——交互作用系數(shù)。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)平行三次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示；采用Minitab 16和Design Expert 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基中最優(yōu)碳源和氮源的篩選(見(jiàn)圖1)

圖1（a） 不同碳源對(duì)產(chǎn)酶活性的影響

圖1（b） 不同氮源對(duì)產(chǎn)酶活性的影響

如圖1（a）所示，B.subtilisBY-3能在不同程度上利用CMC、大麥秸稈、玉米秸稈、可溶性淀粉、麥麩和小麥秸桿，而不能有效利用葡萄糖產(chǎn)纖維素酶，其中以玉米秸稈為單一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中CMCase活性最高，可達(dá)(2.917±0.125)U/ml。因此，選擇價(jià)格低廉且產(chǎn)酶活力高的玉米秸稈作為最佳碳源進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。對(duì)于氮源，如圖1（b）所示，此菌株基本不能利用硫酸銨和尿素兩種無(wú)機(jī)氮源，當(dāng)以蛋白胨和豆粕分別作為單一氮源時(shí)，CMCase活性最高，分別可達(dá)到(2.96±0.057)U/ml和(2.837±0.146)U/ml。由于蛋白胨屬于分析純制劑，價(jià)格昂貴，不利于纖維素酶的大規(guī)模生產(chǎn)，因此采用成本較低的大豆工業(yè)副產(chǎn)品——豆粕作為最佳氮源進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.2 PB篩選試驗(yàn)

分別選取玉米秸稈、豆粕作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源和氮源，綜合考慮其它影響微生物產(chǎn)纖維素酶的微量元素，如 NaCl、MgSO4[19]、K2HPO4、Ca2+和吐溫 80[14-15,20]。本研究選取8個(gè)潛在的影響B(tài).subtilis BY-3產(chǎn)纖維素酶的因素進(jìn)行PB分析。PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表1所示，每個(gè)因素分別選取高（+1）低（-1）兩個(gè)水平，以CMCase活性為響應(yīng)值，得到8因素12試驗(yàn)組合（虛擬變量未顯示）。

表1 Plackett-Burman篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

PB試驗(yàn)的方差分析（ANOVA）結(jié)果如表2所示，對(duì)產(chǎn)酶有顯著影響（置信區(qū)間大于95%）的因素有Na-Cl和玉米秸稈。其中NaCl對(duì)產(chǎn)酶有顯著的負(fù)效應(yīng)（P＜0.05），可適當(dāng)降低其濃度；玉米秸稈對(duì)菌株產(chǎn)酶有極顯著的正效應(yīng)（P＜0.01），可適當(dāng)增大其濃度。然而，其它6個(gè)因素對(duì)產(chǎn)酶沒(méi)有顯著的影響，考慮到生產(chǎn)成本，應(yīng)維持在較低的水平。對(duì)PB試驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到關(guān)于各因素與響應(yīng)值（CMCase活性）的多元一次方程：

式中：Y——纖維素酶CMCase活性預(yù)測(cè)值；

X1～X8——8個(gè)因素的偏碼值。

該模型中決定系數(shù)（R2）為98.3%，表明98.3%的纖維素酶酶活變化可以用該模型來(lái)解釋?zhuān)匠痰臄M合度和模型的相關(guān)性良好；此外，調(diào)整性決定系數(shù)(Adj R2)為93.77%，也進(jìn)一步證明了該模型的可靠性。綜合以上結(jié)果，對(duì)B.subtilisBY-3產(chǎn)酶影響顯著的因素有NaCl和玉米秸稈，可作進(jìn)一步的優(yōu)化，而其它因素則維持在低水平。

表2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)各因素效應(yīng)評(píng)價(jià)和統(tǒng)計(jì)分析

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)（見(jiàn)表3）

響應(yīng)面法雖然可以高效的分析因素間的交互作用，但是只有在考察最大響應(yīng)值的鄰近區(qū)域里才能較好的進(jìn)行方程擬合，更好的反映真實(shí)情況[21]。為了逼近最大產(chǎn)酶區(qū)域，根據(jù)PB試驗(yàn)篩選出的顯著因素效應(yīng)值的正負(fù)和大小，并結(jié)合之前的試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。本研究以PB試驗(yàn)的中心點(diǎn)為爬坡起點(diǎn)，分別以-0.5 g/l和1 g/l作為步長(zhǎng)依次降低NaCl的濃度、提高玉米秸稈的濃度。由表3可知，纖維素酶酶活隨著爬坡的進(jìn)行逐漸增高，當(dāng)NaCl和玉米秸稈的濃度分別達(dá)到6 g/l和28 g/l時(shí)，酶活達(dá)到最大值（5.219±0.073）U/ml，表明最大產(chǎn)酶區(qū)在No.4組試驗(yàn)附近。最陡爬坡試驗(yàn)將為接下來(lái)的響應(yīng)面分析提供試驗(yàn)依據(jù)。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.4 CCD和響應(yīng)面分析（見(jiàn)表4）

表4 中心組合響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在PB試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，運(yùn)用Design Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)了2因素5水平共13組的CCD試驗(yàn)，其中試驗(yàn)中心點(diǎn)為No.4（6，28）。由表4可知試驗(yàn)中各因素的試驗(yàn)值及編碼值，同時(shí)也相應(yīng)給出了試驗(yàn)測(cè)得的CMCase活性及相應(yīng)的預(yù)測(cè)響應(yīng)值。

利用Design Expert 8.0軟件對(duì)中心組合試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析得到B.subtilisBY-3產(chǎn)纖維素酶CMCase活性（Y）對(duì)NaCl（X3）和玉米秸稈（X6）的多元二次回歸方程，如下所示：

式中：Y——預(yù)測(cè)的響應(yīng)值（CMCase活性）；

X3、X6——分別是NaCl和玉米秸稈的編碼值。

對(duì)該二次回歸模型的ANOVA結(jié)果如表5所示，在這個(gè)模型中對(duì)產(chǎn)酶影響極顯著(P＜0.01)，而X3和X6的交互作用對(duì)產(chǎn)酶影響不顯著(P＞0.05)。模型的P值為0.000 2,表明方程擬合度較好,在α=0.01水平上回歸極顯著；失擬項(xiàng)P值為0.064 5，表明殘差由隨機(jī)誤差引起，該模型選擇較好；決定系數(shù)R2為0.953 7，說(shuō)明預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)測(cè)量值之間高度相關(guān)；調(diào)整性決定系數(shù)（Adj R2）為0.920 7，進(jìn)一步表明該模型具有極高的可信度，可以用來(lái)描述試驗(yàn)結(jié)果。上述多元二次回歸方程的三維響應(yīng)曲面及其等高線圖如圖2所示，圖中形象地描述了NaCl和玉米秸稈兩個(gè)因素與響應(yīng)值之間的作用關(guān)系，在NaCl和玉米秸稈的濃度分別為5.772 g/l和28.499 g/l時(shí)，回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)，此時(shí)CMCase活性達(dá)到最高值5.263 U/ml。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證RSM及結(jié)果的可靠性，在發(fā)酵條件不變的情況下分別于產(chǎn)酶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基和優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行試驗(yàn)（每組3個(gè)平行），經(jīng)酶活測(cè)定，后者的平均纖維素酶活為(5.305±0.073)U/ml，與RSM預(yù)測(cè)的結(jié)果(5.263 U/ml)非常相近，說(shuō)明試驗(yàn)值與模型預(yù)測(cè)值擬合良好，該模型可以用來(lái)預(yù)測(cè)該菌株液體發(fā)酵的產(chǎn)酶水平；而基礎(chǔ)培養(yǎng)基的平均酶活為(1.683±0.049)U/ml。經(jīng)優(yōu)化，該菌株最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基為：MgSO4·7H2O 0.3 g/l，K2HPO4·3H2O 1.5 g/l，NaCl 5.772 g/l，酵母粉 0.5 g/l，豆粕 20 g/l，玉米秸稈28.499 g/l，CaCl2·2H2O 0.1 g/l，吐溫80 0.1%(v/v)。

圖2 玉米秸稈和氯化鈉對(duì)羧甲基纖維素酶活性的響應(yīng)面圖及等高線圖

3 討論

纖維素酶在食品加工、飼料工業(yè)、紡織制造等很多領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，對(duì)處理農(nóng)業(yè)廢棄物、解決糧食危機(jī)等具有重大潛力[22]。盡管有很多微生物能夠生產(chǎn)纖維素酶，但是纖維素分解菌的產(chǎn)酶活力偏低、發(fā)酵成本過(guò)高，嚴(yán)重制約著纖維素酶的規(guī)?；a(chǎn)和工業(yè)應(yīng)用。

藏豬是我國(guó)特有的草食地方豬種，在舍飼的條件下，仍可用90%的飼草來(lái)滿足其營(yíng)養(yǎng)需要[23-24]，可見(jiàn)在藏豬腸道內(nèi)存在著能分解纖維素的微生物。在本實(shí)驗(yàn)室先前的研究中，一株嗜熱的纖維素分解菌B.subtilisBY-3從健康的成年藏豬的盲腸內(nèi)容物中成功的篩選出來(lái)，研究其特定的產(chǎn)酶條件對(duì)于揭示藏豬的食草機(jī)理，乃至提高動(dòng)物對(duì)粗纖維飼料的利用率具有重要意義。本研究旨在應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)并優(yōu)化B.subtilisBY-3的產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，以降低發(fā)酵生產(chǎn)成本、提高纖維素酶的產(chǎn)量。首先通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選出以玉米秸稈和豆粕為主要原料的BY-3液體發(fā)酵培養(yǎng)基。玉米秸稈是一種含量豐富、廉價(jià)易得的農(nóng)作物廢物。在我國(guó)，玉米、水稻和小麥?zhǔn)俏覈?guó)的主要糧食作物，每年由此產(chǎn)生的農(nóng)業(yè)秸稈數(shù)量巨大，其中玉米秸稈約占秸稈總量的32.3%[25]；在美國(guó)，每年生產(chǎn)玉米秸稈達(dá)1.96億噸[26]。玉米秸稈中含有細(xì)菌生存所必需的營(yíng)養(yǎng)素，其中纖維素含量約為25%～35%[27-28]，是B.subtilisBY-3產(chǎn)纖維素酶的理想碳源和誘導(dǎo)劑。玉米秸稈不僅可以降低發(fā)酵成本，而且為農(nóng)作物秸稈的有效利用、飼料資源的開(kāi)發(fā)提供了重要依據(jù)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，為了使纖維素酶產(chǎn)量最大化，本研究采用RSM對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了深度優(yōu)化。該方法在生產(chǎn)實(shí)際中已得到廣泛應(yīng)用，Reddy等[29]利用響應(yīng)面法優(yōu)化Bacillus sp.RKY3菌株的發(fā)酵條件，蛋白酶產(chǎn)量增加了近1.3倍；張歡等[30]采用該方法優(yōu)化HA-A38菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基，菌體濃度是優(yōu)化前的近2倍。本研究首先采用二水平設(shè)計(jì)的PB篩選試驗(yàn)分析了8種潛在因素對(duì)B.subtilisBY-3產(chǎn)纖維素酶的影響，并通過(guò)最陡爬坡試驗(yàn)快速高效地逼近了最大的纖維素酶酶活的區(qū)域，最后通過(guò)CCD和響應(yīng)面分析確定了NaCl和玉米秸稈的最優(yōu)濃度。在最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)之上，以3%的接種量42℃、220 r/min條件下深層發(fā)酵24 h后纖維素酶CMCase活性達(dá)(5.305±0.073)U/ml，通過(guò)單因素和響應(yīng)面結(jié)合的優(yōu)化方法，產(chǎn)酶量較優(yōu)化前基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基條件下[(1.683±0.049)U/ml]提高了3.15倍，同時(shí)顯著降低了發(fā)酵成本，這對(duì)纖維素酶的規(guī)?；a(chǎn)、酶制劑的開(kāi)發(fā)、作物秸稈的有效利用都具有重要的借鑒意義。研究同時(shí)進(jìn)一步證明，單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法相結(jié)合是一種行之有效、科學(xué)合理的優(yōu)化響應(yīng)值的方法，可以用來(lái)設(shè)計(jì)和優(yōu)化微生物的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基。

4 結(jié)論

①B.subtilisBY-3可以高效利用廉價(jià)易獲取的農(nóng)業(yè)廢棄物、工業(yè)副產(chǎn)品作為碳源（玉米秸稈）和氮源（豆粕）來(lái)生產(chǎn)纖維素酶，將大大降低生產(chǎn)成本。

②B.subtilisBY-3最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基為：Mg-SO4·7H2O 0.3 g/l，K2HPO4·3H2O 1.5 g/l，NaCl 5.772 g/l，酵母粉0.5 g/l，豆粕20 g/l，玉米秸稈28.499 g/l，CaCl2·2H2O 0.1 g/l，吐溫80 0.1%(v/v)，在此條件下，酶活較基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高了3.15倍。