胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞體外分化成精子細(xì)胞的研究

李明穎 綜述 李永剛 審校

云南省第一人民醫(yī)院生殖遺傳一科（昆明 650032）

胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞體外分化成精子細(xì)胞的研究

李明穎 綜述 李永剛 審校

云南省第一人民醫(yī)院生殖遺傳一科（昆明 650032）

據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，世界上有10%～l5%的育齡夫婦患有不孕不育癥，其中由男性方面因素導(dǎo)致的不孕癥約占30%[1,2]，無精子癥在男性不育患者中的比例約為10%～15%。目前對(duì)于無精子癥病人的主要治療方法如下：（1）對(duì)于梗阻性無精子癥可以從睪丸組織獲得精子或者精子細(xì)胞，行單精子胸漿內(nèi)注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）來治療。（2）對(duì)于先天性生殖異?；蛘吆筇飙h(huán)境、輻射、醫(yī)學(xué)治療等原因造成的永久性生殖異常，臨床上常推薦采用供精人工授精進(jìn)行治療[3,4]，因而無法獲得含有自身遺傳物質(zhì)的后代。原始生殖細(xì)胞（primordial germ cells，PGCs）和胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells, ESCs）以及胚胎生殖細(xì)胞（embryo germ cells, EGCs）相關(guān)，如果能體外培養(yǎng)得到生殖細(xì)胞，此類患者將有希望獲得擁有自己遺傳基因的后代。

ESCs是指在組織生殖層形成前，從早期胚胎中分離出的的具有多能性的干細(xì)胞系[5]。ESCs通常是從移植前的囊胚中獲得的，在體外合適環(huán)境中展示出無限的多能性。過去幾年的研究表明鼠源ESCs（mESCs）可以在體外發(fā)育成PGCs，并且在繼續(xù)培養(yǎng)中，可以偶然的形成早期精子細(xì)胞或者卵原細(xì)胞，卵原細(xì)胞可以形成卵泡或者卵巢類似結(jié)構(gòu)以及卵子[6]。

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是由體細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的多能性干細(xì)胞，同ESCs表現(xiàn)出相似的多能性水平。iPSCs不僅在形態(tài)、生長(zhǎng)特性、干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)方面與ESCs非常相似，在克隆形成、基因表達(dá)、表觀遺傳、分化潛能等方面也與ESCs高度相似，體外可以形成3種生殖層細(xì)胞類型，注射體內(nèi)后可以形成畸胎瘤。

一、生殖細(xì)胞發(fā)育過程

生殖細(xì)胞（Germ cells，GCs）來源于PGCs，將遺傳信息通過基因組帶給下一代。多數(shù)脊椎動(dòng)物原腸胚期的原始生殖細(xì)胞分布于腸道、卵黃囊或尿囊基部的內(nèi)胚層細(xì)胞間，在發(fā)育中沿腸壁遷移，進(jìn)入背腸系膜，最終達(dá)到正在發(fā)育的生殖嵴處，并和生殖嵴的中胚層細(xì)胞共同組成睪丸或卵巢。許多年來，組織非特異性堿磷酸酶（TNAP）的活力被用于標(biāo)記PGCs，及其最終進(jìn)入性腺原基的生殖嵴的過程[7]。這種酶在PGCs、ESCs、EGCs和胚胎源腫瘤細(xì)胞中都有高表達(dá)，這些細(xì)胞都具有全能性。人類PGCs的遷移發(fā)生于孕5周到8周，而在很多個(gè)體中，PGCs在遷移到生殖嵴后會(huì)大量增加，最終成為不遷移的生殖母細(xì)胞[8]。男性中[4]，生殖母細(xì)胞被阻斷在有絲分裂G0期直至出生。出生后，靜止的細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂周期分化成精原細(xì)胞，之后分裂并分化成精母細(xì)胞，進(jìn)而減數(shù)分裂成精子細(xì)胞，并發(fā)育成成熟精子。在睪丸中會(huì)保留一小群精原干細(xì)胞（spermatogonial stem cells, SSCs）。這些細(xì)胞會(huì)持續(xù)的進(jìn)入減數(shù)分裂期并產(chǎn)生單倍體細(xì)胞。而在女性中，PGCs被阻斷在第一次減數(shù)分裂Ⅰ期。出生后，繼續(xù)減數(shù)分裂后被阻斷在減數(shù)分裂Ⅱ期直至排卵前[4,9]。

二、生殖細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因及其在ESCs和iPSCs誘導(dǎo)中的作用

體外分化生殖細(xì)胞的一個(gè)主要困難是缺乏合適的將生殖細(xì)胞從體細(xì)胞中區(qū)分出來的分子標(biāo)志物。目前已知的生殖細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因闡述如下。

Blimp1：近期研究表明，早在受精后6.25d，Blimp1蛋白的表達(dá)可在少至6個(gè)外胚層細(xì)胞中檢測(cè)出來，作為生殖細(xì)胞的標(biāo)志[8]。目前研究認(rèn)為，Blimp1是胚胎中最早可以識(shí)別出PGCs的基因。小鼠中Blimp1的突變會(huì)導(dǎo)致PGCs數(shù)量的減少，以及正常遷移行為的缺失，而在很多個(gè)體中，PGCs在遷移到生殖嵴后會(huì)大量增加，最終成為不遷移的生殖母細(xì)胞。

BMP4、8b：在小鼠中，生殖細(xì)胞的形成由對(duì)胚外外胚層包括生長(zhǎng)因子協(xié)同作用發(fā)出的信號(hào)做出的反應(yīng)而誘導(dǎo)，尤其是BMP4和8b，兩者都是轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子βTGF-β亞家族的成員[10]。成熟BMP4蛋白結(jié)合在異源受體復(fù)合物和下游的Smad蛋白的二聚體，其信號(hào)也通過二者傳遞。BMP4、8b單獨(dú)是不能誘導(dǎo)PGCs從外胚層中培養(yǎng)出來，但結(jié)合后可以，提示各種BMPs的信號(hào)通路可以通過不同的受體復(fù)合物發(fā)生和BMP4非常相關(guān)的BMP2表達(dá)于PGCs形成時(shí)的內(nèi)臟內(nèi)胚層，并且BMP2的失活會(huì)導(dǎo)致PGCs數(shù)目的減少，揭示其在（至少在小鼠中）內(nèi)臟內(nèi)胚層PCGs發(fā)生中的作用[10,11]。

fragilis、Stella：干擾素誘導(dǎo)蛋白fragilis具有抗增殖作用，可以在PGCs中延長(zhǎng)細(xì)胞周期。由于生殖細(xì)胞的命運(yùn)早已被決定，fragilis在其中只有短暫的表達(dá)，但是該基因也在ESCs和EGCs中表達(dá)，提示其在全能性狀態(tài)中的作用。Stella在全能性發(fā)展中有類似的作用，并和染色體重塑或者RNA過程相關(guān)。其在卵子、移植前胚胎以及生殖細(xì)胞源腫瘤中都有表達(dá)[12]。

VASA：免疫組化分析表明，小鼠VASA同源基因（Mvh）蛋白特異的表達(dá)于遷移到生殖腺后的PGCs和經(jīng)歷配子形成過程的生殖細(xì)胞中，直到減數(shù)分裂后期[13]，為生殖細(xì)胞標(biāo)志基因。

Oct4 ：POU區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子OCT4在囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和ESCs中對(duì)于維持全能性很重要。研究表明，Oct4的缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。在人類胎兒組織，Oct4在遷移的PGCs中高表達(dá)，同時(shí)，在人類生殖細(xì)胞腫瘤和EG細(xì)胞中也高表達(dá)[15]。

c-Kit：酪氨酸激酶受體c-Kit及其配體干細(xì)胞因子（SCF），對(duì)兩性生殖中PGCs的維持是必不可少的。在成人睪丸，c-Kit受體在分化的精原細(xì)胞中重新表達(dá)，但在精原干細(xì)胞不表達(dá)，精原干細(xì)胞中，在促卵泡激素的刺激下，Sertoli細(xì)胞表達(dá)SCF[16]。

DAZL：DAZ基因在無精子癥中缺失，Y染色體DAZ基因缺失的男性只有極少或者沒有生殖細(xì)胞，提示他們?cè)谏臣?xì)胞形成或者保持方面有缺陷。DAZ的同源基因DAZL（DAZ-Like）在不同種的生物中被發(fā)現(xiàn)，對(duì)于人類，不論男性女性，其生殖細(xì)胞發(fā)育過程中都需要該基因[9]。

視黃酸（RA）：RA基因是減數(shù)分裂的參與基因并控制男性或者女性表型的分化。低水平的RA會(huì)阻滯生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂，高水平會(huì)誘發(fā)減數(shù)分裂。一些研究表明，卵巢和睪丸有同樣的誘發(fā)減數(shù)分裂的信號(hào)系統(tǒng)但是調(diào)節(jié)時(shí)機(jī)不同。RA信號(hào)是卵巢中誘發(fā)生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂的關(guān)鍵的調(diào)節(jié)子，通過誘導(dǎo)生殖細(xì)胞特異基因Stra8的表達(dá)。相反，胎兒睪丸中，Cyp26b1蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)RA代謝成失活狀態(tài)，使該過程阻滯。出生后睪丸中，RA由靠近精原細(xì)胞的支持細(xì)胞產(chǎn)生并運(yùn)輸，同發(fā)育的卵巢一樣，由于Stra8蛋白表達(dá)上調(diào)，誘發(fā)進(jìn)入減數(shù)分裂[4]。

因此，Blimp1, Stella, fragilis, c-Kit, VASA（Mvh）和DAZL基因的表達(dá)在生殖細(xì)胞分化過程中起到很重要的作用，他們的表達(dá)是具有階段特異性的，因此可以在生殖細(xì)胞發(fā)育的不同階段提供可靠的識(shí)別。

精子在發(fā)生和分化過程中存在著階段特異性的標(biāo)志分子，如多能型標(biāo)志蛋白Nanog、Oct4、Sox2、GDP3[14,15]，PGCs/減數(shù)分裂前期標(biāo)志蛋白Fragilis、Stella、Blimp1、c-Kit、HILI[8,10-12,16,17]，減數(shù)分裂各階段標(biāo)志蛋白DAZL、VASA、CXCR4、PIWI1、UTF1、CDH、SCP3、Prot1、TP1[13,18,19]等，大多數(shù)用于PGCs的標(biāo)志蛋白在ESCs中也存在，如Fragilis,Stella, DAZL, c-Kit等[20]。

研究表明，在培養(yǎng)液中加入重組BMP4有利于人類ESCs（hESCs）的獲得和維持，DAZL、VASA等的過表達(dá)可促進(jìn)正在分化的hESCs/iPSCs形成PGCs[21]，同時(shí)，Toyooka等在模擬體內(nèi)生殖細(xì)胞分化系統(tǒng)產(chǎn)生的擬胚體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)BMP4的表達(dá)，認(rèn)為BMP4在ESCs到PGCs的分化中起到重要作用[22]；Eguizabal等在臍帶血和角化細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的ESCs和iPSCs細(xì)胞系中，均檢測(cè)到Oct4基因的表達(dá)，且生殖細(xì)胞標(biāo)志基因VASA檢測(cè)為陰性。在加入RA誘導(dǎo)培養(yǎng)誘導(dǎo)分化后，Oct4基因表達(dá)下調(diào)，VASA表達(dá)上調(diào)[23]；Lu等認(rèn)為，c-Kit可以在ESC功能性監(jiān)測(cè)中作為標(biāo)志物，其參與的酪氨酸激酶信號(hào)通路在維持ESC不分化狀態(tài)中起到重要作用[24]；Saiti等認(rèn)為c-Kit在調(diào)節(jié)ESCs的生存和分化方面具有和在生殖細(xì)胞系中類似的作用[25]；Nayernia等在ESCs中利用RA誘導(dǎo)篩選出Stra8陽性細(xì)胞，在形成的擬胚體中檢測(cè)到Mvh基因的表達(dá)，并在之后形成的單倍體生殖細(xì)胞中檢測(cè)到Oct4、fragilis、Stella、Mvh、Dazl的表達(dá)，同時(shí)c-Kit表達(dá)增強(qiáng)[26]；Yang等研究表明RA在iPSCs分化成雄性生殖細(xì)胞的過程中起到減數(shù)分裂誘導(dǎo)因素的作用[27]。

三、體外培養(yǎng)ESCs、iPSCs及其分化為精子細(xì)胞的研究進(jìn)展及存在問題

2004年，Clark等報(bào)道從hESCs形成的擬胚體中分化出表達(dá)VAS 和SCP3的GCs[20]；Payer使用Stella-GFP標(biāo)記的mESCs培養(yǎng)表明，不同于Oct4和TNAP的均勻分布，ESCs會(huì)產(chǎn)生非常明確的Stella陽性的細(xì)胞群[28]。在一些細(xì)胞中會(huì)出現(xiàn)明顯的Oct4和Stella的重疊表達(dá)，表明有這種標(biāo)志物結(jié)合的生殖細(xì)胞可能是生殖細(xì)胞類似的ESCs。這表明，可能可以在ESC培養(yǎng)系統(tǒng)加入誘導(dǎo)因子，形成干細(xì)胞微環(huán)境，進(jìn)一步誘導(dǎo)生殖細(xì)胞的發(fā)育。維持這些復(fù)雜小環(huán)境的合適的生長(zhǎng)因子和荷爾蒙微環(huán)境可能取決于培養(yǎng)系統(tǒng)的一些成分[9]；Geijsen等用帶有GFP的Oct4基因進(jìn)行跟蹤，GFP標(biāo)記的mESCs生成單倍體精子后，通過流式分離，行ICSI注射入卵子，可形成囊胚[29]；Toyooka等利用mESCs篩選出的Mvh陽性細(xì)胞研究體外生殖細(xì)胞的分化，將篩選出的細(xì)胞和雄性生殖腺細(xì)胞共移植入小鼠睪丸后檢測(cè)到有標(biāo)記的精子形成[22]。Nayernia等利用傳統(tǒng)2階段培養(yǎng)系統(tǒng)從mESCs得到有類似尾部結(jié)構(gòu)的雄性單倍體生殖細(xì)胞，并檢測(cè)到頂體的形成、核聚集的出現(xiàn)。將該細(xì)胞移植入生殖細(xì)胞缺失的小鼠睪丸后，在管腔中生成精子，行ICSI后形成胚胎移植后得到活產(chǎn)小鼠，并分析了在分化細(xì)胞中的一些印記基因的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)在小鼠中甲基化沒有正確的表現(xiàn)，大多數(shù)在一個(gè)月內(nèi)死亡[26,30]。盡管如此，該結(jié)果仍表明從胚胎干細(xì)胞體外衍生的雄性配子可正常受精并發(fā)育成個(gè)體。在hESCs研究中，Aflatoonian等[19]發(fā)現(xiàn)hESCs在分化的擬胚體中檢測(cè)到成熟生殖細(xì)胞特異基因（VASA、Oct4、DAZL、PRM2、c-Kit、SCP3等）的表達(dá)。

在iPSCs研究方面，2006年，Takahashi等[31]通過在小鼠成纖維細(xì)胞用反轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc4個(gè)基因成功獲得鼠源iPSCs（miPSCs）。2007年，Takahashi等和Yu等分別在人類成纖維細(xì)胞中使用同樣的4個(gè)基因或者Oct4、Sox2、Linm28、Nanog獲得人類iPSCs（hiPSCs）[32,33]。目前研究表明，人類、非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物和鼠的iPSCs都可以在體外分化出VASA和DAZL陽性的PGCs[34,35]。Hayashi等研究表明，iPSC在體外分化成PGCs類似的狀態(tài)，移植到不孕小鼠睪丸后，可以產(chǎn)生有功能的單倍體精子細(xì)胞[36]。Cai等體外加入RA誘導(dǎo)miPSC細(xì)胞分化成Oct4、c-Kit、Mvh陽性的PGCs類似細(xì)胞，將GFP標(biāo)記的miPSCs和胎鼠睪丸細(xì)胞混合移植入雄性小鼠體內(nèi)后，檢測(cè)到源于miPSCs的生精小管組織形成[37]。Yang等利用hiPSCs體外誘導(dǎo)分化產(chǎn)生雄性GCs，將其和睪丸細(xì)胞混合注射到小鼠背部皮膚后，可以重建生精小管[27]。然而，在其他哺乳動(dòng)物中，PGCs恢復(fù)睪丸不育的功能極其有限。另外，睪丸功能環(huán)境也直接影響到移植后PGCs的發(fā)育結(jié)果，因而，對(duì)于睪丸環(huán)境完全失活的病人來說，這種PGCs移植的方法并不可行，最好的方法是iPSCs體外誘導(dǎo)生成精子后，行ICSI進(jìn)行助孕治療。Easley等在體外從hiPGCs直接分化得到精子分化各階段的單倍體細(xì)胞，甚至得到圓形精子[38]。Eguizabal等在誘導(dǎo)產(chǎn)生的hiPSCs中，檢測(cè)到Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞標(biāo)志物陽性的細(xì)胞，提示初級(jí)睪丸位的形成，同時(shí)檢測(cè)到類似于睪丸中早期精原細(xì)胞、精原細(xì)胞和早期人類精子細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)分布（CD9+/CD49F++/CD90-），并通過FISH檢測(cè)到雄性單倍體細(xì)胞的形成[23]。

目前，hESCs的獲得有兩種途徑：（1）捐贈(zèng)IVF胚胎發(fā)育成囊胚后，從內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass, ICM）獲得ESCs；（2）通過體細(xì)胞核移植技術(shù)（somatic cell nuclear transfer, SCNT）獲得胚胎形成囊胚后，從ICM獲得ESCs。第一種方法仍然無法得到繼承了父本基因的后代，而第二種方法在人類疾病治療中由于倫理問題的考慮，不能予以實(shí)施，且在動(dòng)物模型中的實(shí)驗(yàn)表明，將自體體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到卵子中獲得無性生殖ES細(xì)胞的效率很低，約為3%～5%，產(chǎn)生定制配子的效率將更低[39]。hESCs在培養(yǎng)中，為了保持其不分化狀態(tài)，需要飼養(yǎng)層細(xì)胞和動(dòng)物來源的培養(yǎng)成分，這些可能帶來病原體的交叉感染；其次，hESC在長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)中表現(xiàn)出基因組的不穩(wěn)定性和無法預(yù)知的分化方向，可能會(huì)導(dǎo)致生理上的傷害或者群體中累計(jì)的基因突變[39]；在臨床應(yīng)用中，由于用于男性不育后續(xù)治療上存在異體排斥的風(fēng)險(xiǎn)，需要患者長(zhǎng)期進(jìn)行免疫抑制劑的治療[40]。

相對(duì)于ESCs，iPSCs有著更多的優(yōu)勢(shì)：iPSCs源于自體細(xì)胞，設(shè)計(jì)道德倫理方面的問題較少，并且可以用于構(gòu)建病人特異性的細(xì)胞治療模型，在可能的后續(xù)應(yīng)用治療中解決了異體排斥的安全問題。然而，在臨床應(yīng)用中，iPSCs仍然存在一些問題：（1）iPSCs獲得效率低；（2）在誘導(dǎo)過程中對(duì)基因組的修飾可能會(huì)影響到細(xì)胞的重編程。最初的iPSCs是通過反轉(zhuǎn)病毒或者慢病毒載體導(dǎo)入特定基因獲得[32,33]，這種誘導(dǎo)因子的引入和對(duì)基因組的整合，可能導(dǎo)致細(xì)胞染色體的修飾，反轉(zhuǎn)病毒載體的引入，可能引起原癌基因的激活，這些給iPSCs的臨床應(yīng)用帶來巨大的阻礙。近年來，大量的研究集中在如何在不引起基因組改變的條件下獲得iPSCs。隨著研究的深入，iPSCs的誘導(dǎo)因子從最初的4個(gè)逐步簡(jiǎn)化至1個(gè)[41-44]，重編碼方法也從最初的反轉(zhuǎn)病毒載體介導(dǎo)，發(fā)展到后來的腺病毒介導(dǎo)、DNA載體介導(dǎo)、mRNA轉(zhuǎn)染、重組蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)等方法[45-48]。較于病毒載體介導(dǎo)方法，DNA載體介導(dǎo)雖然相對(duì)安全簡(jiǎn)便，但仍存在基因組重組風(fēng)險(xiǎn)，且重編碼的效率極低；mRNA的應(yīng)用可獲得較高的重編碼效率，但技術(shù)相對(duì)復(fù)雜；重組蛋白技術(shù)涉及到蛋白重組及純化技術(shù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求較高且實(shí)施成本較高，但其高度的安全性在日后的應(yīng)用中仍然值得考慮[49,50]。

四、結(jié)論

研究表明，mESCs和hESCs均可以在體外分化成為單倍體雄性生殖細(xì)胞，但ESCs由于涉及到SCNT技術(shù)和胚胎等倫理問題，其臨床應(yīng)用受到了極大的限制。相比之下，iPSCs源于自體細(xì)胞，逃開了胚胎來源的倫理問題，是目前唯一可以建立患者特異性疾病研究模型的資源。目前，已有研究表明，iPSCs不僅可以在體外分化成體細(xì)胞系，也可以分化成生殖細(xì)胞系。如果能利用無精子癥患者體細(xì)胞體外培養(yǎng)iPSCs，可以嘗試建立男性無精子癥疾病原因篩查的模型[51]；同時(shí)，利用患者iPSCs誘導(dǎo)其分化為有功能的雄性單倍體細(xì)胞，為不孕癥夫婦的IVF治療提供材料，將為男性不育患者的治療提供一個(gè)新的思路。

胚胎干細(xì)胞; 多能干細(xì)胞; 精子;細(xì)胞分化

1 Samli H, Samli MM, Solak M,et al. Arch Androl2006; 52(4): 263-267

2 Dohle GR, Colpi GM, Hargreave TB,et al. Eur Urol2005; 48(5): 703-711

3 Lee DR, Kim KS, Yang YH,et al. Hum Reprod2006; 21(2): 471-476

4 Marques-Mari AI, Lacham-Kaplan O, Medrano JV,et al. Hum Reprod Update2009; 15(3): 379-390

5 Smith A.Nature2006; 441: 1060

6 Hubner K, Fuhrmann G, Christenson LK,et al. Science2003; 300(5623): 1251-1256

7 McLaren A.Dev Biol2003; 262(1):1-15

8 Vincent SD, Dunn NR, Sciammas R,et al. Development2005; 132(6): 1315-1325

9 Aflatoonian B, Morre H.Reproduction2006; 132(5): 699-707

10 Shimasaki S, Moore RK, Otsuka F,et al. Endocr Rev2004; 25(1): 72-101

11 Ying Y, Qi X, Zhao GQ.Proc Natl Acad Sci U S A2001; 98(14): 7858-7862

12 Payer B, Saitou M, Barton SC,et al. Curr Biol2003; 13(23): 2110-2117

13 Toyooka Y, Tsunekawa N, Takahashi Y,et al. Mech Dev2000; 93(1-2): 139-149

14 Kehler J, Tolkunova E, Koschorz B,et al. EMBO Rep2004; 5(11): 1078-1083

15 Looijenga LH, Stoop H, de Leeuw HP,et al. Cancer Res2003; 63(9): 2244-2250

16 Rossi P, Sette C, DolciS,et al. J Endocrinol Invest2000; 23(9): 609-615

17 Saitou M, Barton SC, Surani MA.Nature2002; 418(6895): 293-300

18 Moore FL, Jaruzelska J, Fox MS,et al. Proc Natl Acad Sci U S A2003; 100(2): 538-543

19 Aflatoonian B, Ruban L, Jones M,et al. Hum Reprod2009; 24(12): 3150-3159

20 Clark AT, Bodnar MS, Fox M,et al. Hum Mol Genet2004; 13(7): 727-739

21 Hayashi Y, Saitou M, Yamanaka S.Fertil Steril2012; 97(6): 1250-1259

22 Toyooka Y, Tsunekawa N, Akasu R,et al. Proc Natl Acad Sci U S A2003; 100(20): 11457-11462

23 Eguizabal C, Montserrat N, Vassena R,et al. Stem Cells2011; 29(8): 1186-1195

24 Lu M, Glover CH, Tien AH,et al. Exp Hematol2007; 35(8): 1293-1302

25 Saiti D, Lacham-Kaplan O.Biomark insights2007; 2: 241-252

26 Nayernia K, Nolte J, Michelmann HW,et al. Dev Cell2006; 11(1): 125–132

27 Yang S, Bo J, Hu H,et al. Cell Prolif2012; 45(2): 91-100

28 Payer B, Chuva de Sousa Lopes SM, Barton SC,et al. Genesis2006; 44(2): 75-83

29 Geijsen N, Horoschak M, Kim K,et al. Nature2004; 427(6970): 148–154

30 Nayernia K, Lee JH, Drusenheimer N,et al. Lab Invest2006; 86(7): 654-663

31 Takahashi K, Yamanaka S.Cell2006; 126(4): 663-76

32 Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M,et al. Cell2007; 131(5): 861-872

33 Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K,et al. Science2007; 318(5858): 1917-1920

34 Easley CA 4th, Latov DR, Simerly CR,et al. Fertil Steril2014; 101(1): 14-19

35 Eguizabal C, Montserrat N, Vassena R,et al. Stem Cells2011; 29(8): 1186-1195

36 Hayashi K, Ohta H, Kurimoto K,et al. Cell2011; 146(4): 519-532

37 Cai H, Xia X, Wang L,et al. Biochem Biophys Res Commun2013; 433(3): 286-291

38 Easley CA 4th, Phillips BT, McGuire MM,et al. Cell Rep2012; 2(3): 440-446

39 Master Z.Hum Reprod2006; 21(4): 857-86340 Stojkovic M, Lako M, Strachan T,et al. Reproduction2004; 128(3): 256-267

41 Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K,et al. Nat Biotechnol2008; 26(1): 101-106

42 Kim JB, Zaehres H, Wu G,et al. Nature2008; 454(7204): 646-650

43 Huangfu D, Osafune K, Maehr R,et al. Nat Biotechnol2008; 26(11): 1269-1275

44 Kim JB, Sebastiano V, Wu G,et al. Cell2009; 136(3): 411-419

45 Stadtfeld M, Nagaya M, Utikal J,et al. Science2008; 322(5903): 945-949

46 Yu J, Hu K, Smuga-Otto K,et al. Science2009; 324(5928): 797-801

47 Warren L, Manos PD, Ahfeldt T,et al. Cell Stem Cell2010; 7(5): 618-630

48 Kim D, Kim CH, Moon JI,et al. Cell Stem Cell2009; 4(6): 472-476

49 Wang T, Zhao HS, Zhang QL,et al. Chin Med Sci2013; 28(1): 50-54

50 Zhou YY, Zeng F.Genomics Proteomics Bioinformatics2013; 11(5) : 284-287

51 Easley CA 4th, Simerly CR, Schatten G.Reprod Biomed Online2013; 27(1): 75-80

（2014-06-28收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.10.017

R 698.2