非梗阻性無(wú)精子癥患者TSG23基因的單核苷酸變異分析*

江智茂 龔英皓 李俞池 林首任 陳劍波 桂耀庭

北京大學(xué)深圳醫(yī)院男性生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（深圳 518036）

·論 著·

非梗阻性無(wú)精子癥患者TSG23基因的單核苷酸變異分析*

江智茂 龔英皓 李俞池 林首任 陳劍波 桂耀庭**

北京大學(xué)深圳醫(yī)院男性生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（深圳 518036）

目的分析TSG23基因在非梗阻性無(wú)精子癥患者中單核苷酸變異。方法采用第二代高通量測(cè)序方法對(duì)臨床收集的776例非梗阻性無(wú)精子癥患者和709例已正常生育男性的外周血DNA進(jìn)行TSG23基因外顯子捕獲測(cè)序；采用傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序技術(shù)對(duì)第二代高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)的新的突變位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果經(jīng)過(guò)對(duì)測(cè)序質(zhì)量控制和外顯子測(cè)序結(jié)果分析篩選，有757例患者和709例的測(cè)序結(jié)果納入生物信息學(xué)分析，共獲得7個(gè)突變位點(diǎn)，其中3個(gè)為同義突變，4個(gè)為錯(cuò)義突變，有4個(gè)位點(diǎn)為新發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)；所有位點(diǎn)中非梗阻性無(wú)精子癥患者特有的突變位點(diǎn)1個(gè)，為同義突變，已育正常男性特有的突變位點(diǎn)2個(gè)，均為錯(cuò)義突變。結(jié)論 現(xiàn)有的檢測(cè)結(jié)果顯示，TSG23基因的單核苷酸變異與非梗阻性無(wú)精子癥的發(fā)生無(wú)明顯的相關(guān)性。

無(wú)精子癥; 基因; 單核苷酸變異

不孕不育癥是一類嚴(yán)重危害人類身心健康的疾病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)資料，不孕不育癥占育齡夫婦的20%左右，其中男性因素導(dǎo)致不孕不育的占50%[1]。隨著社會(huì)工業(yè)化程度的提高和生活節(jié)奏的加快，加上環(huán)境污染和不良生活習(xí)慣等因素，男性精液質(zhì)量日趨下降，男性不育人數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)，男性生殖健康的問(wèn)題越來(lái)越受到全社會(huì)的關(guān)注[2]。

無(wú)精子癥是男性不育的重要原因之一，占男性不育的20%～25%左右[3,4]。有30%～40% 的無(wú)精子癥患者病因不明，稱為原發(fā)性無(wú)精子癥[5]。近年來(lái)，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們已發(fā)現(xiàn)近200個(gè)基因與男性不育癥的發(fā)生密切相關(guān)，近400個(gè)基因與小鼠精子發(fā)生密切相關(guān)[6]，這些基因的突變或缺失，可能是某些原發(fā)性男性不育癥發(fā)生的重要原因。

本實(shí)驗(yàn)室采用基因組芯片技術(shù)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)睪丸表達(dá)特異性新基因，其蛋白質(zhì)分子量為23 kd，故命名為睪丸特異性高表達(dá)基因23（Testis specific gene 23，TSG23）。該基因僅在出生后15d以后的小鼠睪丸組織和成人睪丸中表達(dá)，且呈年齡依賴性升高；與正常睪丸組織比較，TSG23在無(wú)精子癥患者睪丸組織中的表達(dá)顯著減少或消失[7]。上述結(jié)果提示該基因在精子發(fā)生的過(guò)程中可能具有重要作用。本研究收集了776例非梗阻性性無(wú)精子癥患者和709例已正常生育男性的血液標(biāo)本，采用外顯子捕獲測(cè)序、PCR和Sanger測(cè)序方法，檢測(cè)并驗(yàn)證TSG23基因在非梗阻性無(wú)精子癥患者的單核苷酸變異，探討TSG23基因與無(wú)精子癥發(fā)生的相關(guān)性。

材料與方法

一、臨床樣本收集

本課題組從2007年6月至2011年10月共收集1 880例無(wú)精子癥患者，其中非梗阻性無(wú)精子癥患者776例，篩選標(biāo)準(zhǔn)：隨機(jī)檢查三次精液中均無(wú)精子；無(wú)生殖系統(tǒng)阻塞、炎癥和損傷；無(wú)核型異常和Y染色體微缺失。另將709例正常生育男性（至少育有一孩，且未行IVF、ICSI、IMSI等人類輔助生殖技術(shù)）作為對(duì)照組進(jìn)行研究。每例受試者均簽署知情同意書(shū)，本研究通過(guò)北京大學(xué)深圳醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審查批準(zhǔn)。

二、DNA提取和基因捕獲測(cè)序

采用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取外周血基因組DNA，取出5μg基因組DNA送深圳華大基因研究院進(jìn)行外顯子捕獲測(cè)序。

三、PCR和Sanger測(cè)序

以外周血基因組DNA為模板，使用設(shè)計(jì)合成的兩對(duì)引物對(duì)新發(fā)現(xiàn)的單核苷酸變異進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增，條件為：98℃預(yù)變性5min，然后以98℃ 10s、60℃ 30s、72℃ 45s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min，產(chǎn)物在4℃保存，送上海立菲生物技術(shù)有限公司測(cè)序。引物序列見(jiàn)表1。

表1TSG23單核苷酸變異驗(yàn)證引物序列

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、TSG23基因的單核苷酸變異

經(jīng)過(guò)對(duì)測(cè)序質(zhì)量控制和外顯子測(cè)序結(jié)果分析篩選，有757例患者和709例的測(cè)序結(jié)果納入生物信息學(xué)分析，共獲得7個(gè)突變位點(diǎn)，其中3個(gè)為同義突變，4個(gè)為錯(cuò)義突變，在已有數(shù)據(jù)庫(kù)中可以找到3個(gè)位點(diǎn)，分別為rs141224523、rs3827040和rs146821586，有4個(gè)位點(diǎn)為新發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)；所有位點(diǎn)中非梗阻性無(wú)精子癥患者特有的突變位點(diǎn)1個(gè)，為同義突變，正常生育男性特有的突變位點(diǎn)2個(gè)，均為錯(cuò)義突變（見(jiàn)表2）。與正常生育男性比較，非梗阻性無(wú)精子癥患者TSG23基因單核苷酸變異無(wú)顯著性差異。

表2TSG23在非梗阻性無(wú)精子癥和正常生育男性中的點(diǎn)突變情況

二、Sanger測(cè)序法驗(yàn)證結(jié)果

采用傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序技術(shù)對(duì)第二代高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)的新的突變位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，在驗(yàn)證的9例結(jié)果中，均為雜合突變（見(jiàn)圖1），與第二代高通量測(cè)序結(jié)果一致。

圖1TSG23基因單核苷酸變異位點(diǎn)的驗(yàn)證

討 論

無(wú)精子癥可分為梗阻性無(wú)精子癥和非梗阻性無(wú)精子癥。梗阻性無(wú)精子癥大約占無(wú)精子癥患者的40%，主要原因包括先天性發(fā)育異常、精索靜脈曲張和生殖道感染等[8]。大量的研究表明，遺傳因素是導(dǎo)致非梗阻性無(wú)精子癥發(fā)生的主要原因，如染色體核型異常、Y染色體微缺失、基因突變與缺失以及基因的單核苷酸多態(tài)性等[9,10]。

近年來(lái)，人們一直在尋找與精子發(fā)生和生精障礙相關(guān)的基因突變、缺失或單核苷酸多態(tài)性[11]。Iris等[12]采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序比較217例非梗阻男性不育癥患者和162例正常生育男性PRDM9基因的SNP差異，發(fā)現(xiàn)18327C/A位點(diǎn)在兩組人群中存在顯著性差異，提示PRDM9可能是原發(fā)性不育的易感基因。Wang等[13]采用PCR-RFLP比較252名非梗阻男性不育和246個(gè)證明可育男性的FASLG基因的SNP位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)844C/T位點(diǎn)在兩組人群中存在顯著性差異。Zhang等[14]采用DHPLC比較347名非梗阻男性不育和201個(gè)證明可育男性的GRTH基因的SNP位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)IVS6+55G/T位點(diǎn)在兩組人群中存在顯著性差異。Teng等[15]對(duì)中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)男性人群非梗阻性無(wú)精子癥及嚴(yán)重少精子癥患者DAZL基因全長(zhǎng)編碼序列進(jìn)行了篩查，發(fā)現(xiàn)了位于第3外顯子第386位核苷酸A→G SNP，該SNP引起了其編碼蛋白第54位氨基酸由蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼幔═54A）。進(jìn)一步分析表明T54A等位基因G與生精障礙有顯著關(guān)聯(lián)。Hu等采用全基因組關(guān)聯(lián)分析方法，比較1 000例非梗阻性無(wú)精子癥患者與1700例正常生育男性全基因組SNP的差異，并在2 000例患者和4 000例正常生育男性中進(jìn)行驗(yàn)證，確定1p13.3，1p36.32和12p12.1，3個(gè)染色體區(qū)域在非阻塞性無(wú)精子癥和正常生育男性中存在顯著性變異[16]。

人TSG23（GenBank 登錄號(hào)：NM_080608）定位在20q13.12，全長(zhǎng)有752bp，在10至693 bp之間有一閱讀框，含有684bp的完整ORF，編碼227個(gè)氨基酸。TSG23基因包括2個(gè)外顯子、1個(gè)內(nèi)含子及上游的表達(dá)調(diào)控序列，總長(zhǎng)度為2137bp。SNP數(shù)據(jù)庫(kù)資料顯示，TSG23基因有15個(gè)可能的SNP或突變位點(diǎn)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人TSG23基因在正常生育男性和非梗阻性無(wú)精子癥患者中均存在同義突變或錯(cuò)義突變。我們現(xiàn)有的分析結(jié)果表明，TSG23基因的單核苷酸變異與非梗阻性無(wú)精子癥的發(fā)生無(wú)明顯的相關(guān)性。

1 Visser L, Repping S. Unravelling the genetics of spermatogenic failure.Reproduction2010; 139(2): 303-307

2 Fisch H. Declining worldwide sperm counts: disproving a myth.Urol Clin North Am2008; 35(2):137-46

3 Jarvi K, Lo K, Fischer A, et al. CUA Guideline: The workup of azoospermic males.Can Urol Assoc J2010; 4(3): 163-167

4 Wu B, Lu NX, Xia YK, et al.A frequent Y chromosome b2/b3 subdeletion shows strongly association with male infertility in Han-Chinese population.Hum Reprod2007; 22(4): 1107-1113

5 Cavallini G. Male idiopathic oligoasthenoteratozoospermia.Asian J Androl2006; 8 (2): 143-157

6 Matzuk MM, Lamb DJ. The biology of infertility: research advances and clinical challenges.Nat Med2008; 14(11): 1197-1213

7 Zhou Y, Qin D, Tang A,et al.Developmental expression pattern of a novel gene, TSG23/Tsg23, suggests a role in spermatogenesis.Mol Hum Reprod2009 15(4):223-230

8 Marmar JL. Techniques for microsurgical reconstruction of obstructive azoospermia.Indian J Urol2011; 27(1): 86-91

9 Martin RH. Cytogenetic determinants of male fertility.Hum Reprod Update2008; 14(4): 379-90

10 McLachlan RI, O'Bryan MK. Clinical Review#: State of the art for genetic testing of infertile men.J Clin Endocrinol Metab2010; 95(3): 1013-1024

11 Carrell DT, Aston KI. The search for SNPs, CNVs, and epigenetic variants associated with the complex disease of male infertility.Syst Biol Reprod Med2011; 57(1-2): 17-26

12 Irie S, Tsujimura A, Miyagawa Y,et al. Single Nucleotide Polymorphisms in PRDM9 (MEISETZ) in Patients with Nonobstructive Azoospermia.J Androl2009; 30(4): 426-431

13 Wang W, Lu N, Xia Y,et al. FAS and FASLG polymorphisms and susceptibility to idiopathic azoospermia or severe oligozoospermia.Reprod Biomed Online2009; 18(1): 141-147

14 Zhang SZ, Yang Y,et al. Single nucleotide polymorphisms of the gonadotrophin-regulated testicular helicase (GRTH) gene may be associated with the human spermatogenesis impairment.Hum Reprod2006; 21(3): 755-759

15 Teng YN, Lin YM, Lin YH,et al.Association of a single Nucleotide polymorphism of the deleted in azoospermialike gene with susceptibility to spermatogenic failure.J Clin Endocrinol Metab2002; 87(11): 5258-5264

16 Hu Z, Xia Y, Guo X,et al. A genome-wide association study in Chinese men identif es three risk loci for nonobstructive azoospermia.Nat Genet2012; 44(2): 183-186

（2014-08-14收稿）

Single nucleotide variation of TSG23 gene in patients with nonobstructive azoospermia*

Jiang Zhimao, Gong Yinghao, Li Yuchi, Lin Shouren, Chen Jianbo, Gui Yaoting**Key Laboratory of Male Reproductive Medicine and Genetics, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, China

Gui Yaoting, E-mail: guiyaoting2007@aliyun.com; Te1: 0755-83923333-3320

ObjectiveTo analyze the single nucleotide variation (SNV) ofTSG23gene in patients with non obstructive azoospermia.MethodsAll the exons ofTSG23gene in 776 patients diagnosed with non-obstructive azoospermia and 709 proven fertile men were sequenced. The novel mutations were validated by PCR and Sanger sequencing analysis.ResultsAfter the quality control for sequencing results, the data from 757 patients and 709 proven fertile men were analyzed by bioinformatics methods. Seven mutations were identif ed, including 3 synonymous mutations and 4 missense mutations, and 4 of them were novel mutations. One synonymous mutation was specif c in non-obstructive azoospermia patients, and two missense mutations were specific in proven fertile men.ConclusionAccording to the analysis of SNV data on TSG23gene, All the data indicates SNV of gene TSG23 is not associated with ocurrence of nonobstructive azoospermia.

azoospermia; genes; single nucleotide variation

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.10.001

Q 492.4

資助: 深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201202001，201302053）; 國(guó)家重大科學(xué)研究計(jì)劃（2011CB944303）
**

, E-mail: guiyaoting2007@aliyun.com; Te1: 0755-83923333-3320;