益精方對(duì)小鼠精子線粒體功能的影響

李 柱羅少波張金穎賈金銘胡海翔

1. 空軍總醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科（北京 100142）;

2. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院南區(qū)男科; 3. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院男科

益精方對(duì)小鼠精子線粒體功能的影響

李 柱1羅少波2張金穎2賈金銘3*胡海翔1

1. 空軍總醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科（北京 100142）;

2. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院南區(qū)男科; 3. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院男科

目的觀察益精方對(duì)環(huán)磷酰胺所致少弱精子癥模型小鼠精子線粒體功能的影響。方法將 40只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（CG）、模型組（MG）、小劑量中藥治療組（SG）和大劑量中藥治療組（LG）。按60mg/kg體質(zhì)量給CG小鼠腹腔注射生理鹽水（NS），給MG、SG、LG小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺，每天1次，連續(xù)5d，第6天開始按體質(zhì)量分別給SG和LG小鼠灌服益精方，劑量分別為人類常規(guī)用量（以60 kg為標(biāo)準(zhǔn)）的1倍和5倍，MG小鼠給予等體積的NS灌胃，每天1次， 連續(xù)34 d，CG常規(guī)飼養(yǎng)，然后對(duì)小鼠進(jìn)行精液常規(guī)分析，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)精子線粒體功能。結(jié)果CG、MG、SG和LG 組小鼠附睪精子密度分別為（5.20±1.34）、（1.73±0.03）、（2.08±0.01）、（3.31±0.56）×106/mL；精子活力[（a+b）級(jí)精子百分率]分別為（14.49±0.30）%、（6.64± 1.88）%、（11.99±1.01）%、（19.40±3.13）%；精子活率[（a+b+c）級(jí)精子百分率]分別為（68.39±15.13）%、（39.96±4.89）%、（62.28±4.43）%、（73.61±5.05）%。MG組精子密度、精子活力、精子活率顯著低于CG組（P＜0.05）；經(jīng)治療后LG組精子密度、精子活力和精子活率明顯增加，與MG組比較有顯著性差異（P＜0.05），而與CG組在精子活力和精子活率上沒有明顯區(qū)別。在CG、MG、SG和LG組，線粒體功能良好精子的百分率分別為（1105.93±0.33）%、（848.55±6.15）%、（888.77±22.46）%、（1000.885±72）%，線粒體功能喪失精子的百分率分別為（27.94±0.32）%、（42.43±1.00）%、（35.11±1.23）%、（30.91±0.44）%，MG小鼠精子線粒體功能良好的表達(dá)量明顯下降，而線粒體功能喪失的表達(dá)量明顯增多，與CG小鼠比較均有明顯差異（P＜0.05）； 經(jīng)治療后，LG小鼠精子線粒體功能良好的表達(dá)量顯著性增加（P＜0.05），同時(shí)線粒體功能喪失的表達(dá)量明顯減少，與MG小鼠比較有明顯差異（P＜0.05）。結(jié)論腹腔注射環(huán)磷酰胺可使小鼠精子密度、精子活力、精子活率降低，大劑量益精方可以增加小鼠精子密度，并增加精子線粒體功能，提高精子活力和精子活率，從而達(dá)到治療少弱精子癥的目的。

益精方; 線粒體; 弱精子癥; 小鼠

我國(guó)育齡夫婦患不育癥的發(fā)病率在10%左右，并有增加的趨勢(shì)，其中因男性生育能力缺欠所致的不育癥約占50%[1]。以“益精方”為代表的中醫(yī)藥治療男性不育癥之少弱精子癥療效明顯[2,3]，但其治療機(jī)制一直不甚明了，本研究試圖從精子線粒體功能的角度對(duì)其治療弱精子癥的機(jī)制進(jìn)行解讀。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)雄性昆明小白鼠40只（購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所），體重18～20 g，采用數(shù)字法隨機(jī)分為對(duì)照組（control group, CG）、模型組（model group, MG）、小劑量中藥治療組（small dose group, SG）、大劑量中藥治療組（large dose group, LG），每組10只。

二、主要器材

流式細(xì)胞儀：美國(guó)B D公司產(chǎn)品，型號(hào)：FACSCalibur; Allagra.21R Centrifcige高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)BACKMAN公司）；DU640型紫外線分光光度計(jì)（德國(guó)BACKMAN公司）；WL-9000型偉力精子分析儀（北京偉力新世紀(jì)科技發(fā)展有限公司）；DRHW-1型恒溫水浴箱（北京市醫(yī)療設(shè)備總廠）等。

三、主要試劑

羅丹明123（Rhodamine 123,Rh123）和碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）：均為Sigma公司產(chǎn)品，Rh123，Cat：R8004，用蒸餾水配制為1 g/L儲(chǔ)存液，0～4℃避光保存?zhèn)溆?；PI，Cat：P4170。

BWW低蛋白培養(yǎng)液、BWW高蛋白獲能液：NaCl 554 mg/100 mL，KCl 35.6 mg/100 mL，KH2PO416.2 mg/100 mL，NaHCO3210 mg/100 mL，葡萄糖100 mg/100 mL，丙酮酸鈉 3 mg/100 mL，乳酸鈉 370 μl/100 mL，慶大霉素 125 μl/100 mL，0.5%酚紅 50 μl/100 mL。精子處理用含0.3%人血清白蛋白的BWW低蛋白液，精子獲能用含3.5%人血清白蛋白的BWW高蛋白獲能液。

孵育緩沖液：10 mmol/ L HEPES、140 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L CaCl2，pH =7.4。

PBS液：8g/L NaCl、0.2 g/L KCl、1.44 g/L Na2HPO4?7H2O、 0.24 g/L KH2PO4?H2O、 pH =7.2。

四、實(shí)驗(yàn)用藥

“益精方”主要成分：當(dāng)歸、紅花、五味子、菟絲子、桑葚、桑螵蛸、炒蒼術(shù)、仙靈脾、肉蓯蓉、韭菜子、黃精、玉竹、熟地等，每付藥材中含生藥199g，按常規(guī)方法煎熬并濃縮成含生藥1g/mL的藥液，冷藏于4℃冰箱備用。

五、方法

實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)性馴養(yǎng)5 d后，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)告[4]及預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，CG按體質(zhì)量60 mg/kg腹腔注射生理鹽水（NS），MG、SG、LG按體質(zhì)量60 mg/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺，每天1次，連續(xù)5 d。從第6天開始給予治療藥物（記為d1，以后按時(shí)間順序依次記錄為d2、d3……）以人體60 kg為標(biāo)準(zhǔn)，按體質(zhì)量分別給SG和LG小鼠灌服“益精方”，劑量分別為人類常規(guī)用量（每天每公斤體質(zhì)量消耗生藥量約為3.3 g）的1倍和5倍并用NS將藥液體積調(diào)配成相同大小，MG小鼠給予等體積的NS灌胃，每天1次，共灌胃34 d。灌胃期間，每周給小鼠稱量1次，并根據(jù)新的體重調(diào)整灌胃藥量。灌胃結(jié)束后的第二天將實(shí)驗(yàn)小鼠處死后迅速摘取睪丸、附睪、輸精管，迅速剝除粘連的血管、韌帶及脂肪等組織，備用。

（一）小鼠精子的采集

雙側(cè)附睪置于潔凈培養(yǎng)皿中，用眼科剪沿附睪縱軸剪一刀使其分為大致均勻的兩半，然后沿橫軸剪兩刀使附睪分為大致均勻的6段，將剪碎的附睪組織移入預(yù)置常溫孵育緩沖液1 mL的試管中，然后用1 mL孵育緩沖液沖洗培養(yǎng)皿，沖洗液移入裝附睪的試管中。

摘取睪丸和附睪后，分離輸精管，于輸精管與附睪尾結(jié)合部、輸精管與前列腺結(jié)合部剪切離斷輸精管。用胰島素注射針抽取孵育緩沖液1 mL，沿輸精管一側(cè)斷端將針頭插入輸精管管腔內(nèi)，輕推注射器，可見另一側(cè)斷端流出1～2滴乳白或灰白色液體，內(nèi)含大量精子，將所得液體滴入裝附睪的試管中，并用注射器中剩余孵育緩沖液沖洗輸精管管腔，并將液體全部滴入裝附睪的試管中。將所得精子置于37℃恒溫孵育箱中孵育30 min備用。

（二） 精子常規(guī)分析

精子于37℃恒溫孵育箱中孵育30 min后，小心吸取上層液體，360×g，離心5 min，沉淀物加入1 mL BWW高蛋白獲能液，置于37℃恒溫孵育箱中獲能2 h，參照人類精子分析方法用偉力精子分析儀對(duì)精子密度、精子活力等進(jìn)行常規(guī)分析。

六、精子線粒體功能測(cè)定

精子于37℃恒溫孵育箱中孵育30min后，小心吸取上層液體，360×g，離心5min，沉淀物加入PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）洗滌2次后離心360×g，離心5min。PBS懸浮沉淀精子，調(diào)精子密度為1×106/m，加入Rh123（終濃度10μg/mL），置于37℃水浴孵育10 min，離心棄上清， PBS重復(fù)洗滌離心2次， PBS懸浮，加入PI（終濃度10μg/mL）染色5 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS11.5軟件對(duì)正態(tài)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行ONEWAY ANOVA檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)用±s表示。P＜0.05為有顯著性差異。

結(jié) 果

一、小鼠附睪精子常規(guī)檢查結(jié)果

結(jié)果表明，與C G比較，M G精子密度、精子活力[（a+b）級(jí)精子百分率]、精子活率[（a+b+c）級(jí)精子百分率]顯著下降（P＜0.05）；與MG比較，LG精子密度、精子活力、精子活率有明顯升高（P＜0.05），見表1。

表1 小鼠精子密度、活力及活率比較（±s, n=10）

表1 小鼠精子密度、活力及活率比較（±s, n=10）

注: 與CG比較, :P＜0.05; 與MG比較, #:P＜0.05; 與SG比較, :P＜0.05

度(×106/mL) (a+b)級(jí)精子(%)組別 精子密(a+b+c)級(jí)精子(%) CG 5.20±1.34 14.49±0.30 68.39±15.13 MG 1.73±0.03*6.64±1.88*39.96±4.89*SG 2.08±0.01*11.99±1.01 62.28±4.43#LG 3.31±0.56*#19.40±3.13#▲73.61±5.05#*▲

二、線粒體功能測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明，與CG比較，MG小鼠精子線粒體Rh123表達(dá)明顯下降，而PI表達(dá)明顯增多（P＜0.05）；與MG比較，LG小鼠精子線粒體RH123表達(dá)顯著性增加，同時(shí)PI表達(dá)明顯減少（P＜0.05），見表2，圖1。

表2 線粒體功能測(cè)定結(jié)果比較（±s , n=10）

表2 線粒體功能測(cè)定結(jié)果比較（±s , n=10）

注: 與CG比較,*:P＜0.05; 與MG比較, #:P＜0.05; 與SG比較,▲:P＜0.05; Rh123%: 線粒體功能良好的精子百分?jǐn)?shù); PI%: 線粒體功能喪失的精子百分?jǐn)?shù)

Rh123% PI% CG 1105.93±0.33 27.94±0.32 MG 848.55±6.15*42.43±1.00*SG 888.77±22.46*35.11±1.23*# LG 1000.885±72*#▲30.91±0.44*#▲

討 論

精子運(yùn)動(dòng)依賴線粒體提供能量，當(dāng)精子線粒體功能異常，其能量合成減少，導(dǎo)致了精子活動(dòng)力減弱。線粒體功能是通過氧化磷酸化合成ATP，為精子運(yùn)動(dòng)提供能量，而ATP合成過程與線粒體內(nèi)電子傳遞有關(guān)。因此精子線粒體結(jié)構(gòu)是否完好以及線粒體DNA是否受損，將影響到線粒體內(nèi)ATP能量合成，進(jìn)而影響精子活力、活率甚至精子的存活。

圖1 線粒體功能散點(diǎn)圖

環(huán)磷酰胺為目前廣泛應(yīng)用的烷化劑類抗腫瘤藥物，其進(jìn)入體內(nèi)被肝臟或腫瘤內(nèi)過量的磷酰胺酶或磷酸酶水解，變?yōu)橛谢钚缘牧柞０返?，與DNA 發(fā)生交叉聯(lián)結(jié)，抑制DNA的合成，也可干擾RNA的功能，可對(duì)人體多系統(tǒng)產(chǎn)生毒副作用[5]。環(huán)磷酰胺腹腔注射后，模型組小鼠出現(xiàn)精子活力和活率明顯下降，出現(xiàn)明顯的弱精子癥表現(xiàn)，這一作用可能與精子線粒體功能損傷有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)表明，造模后小鼠線粒體功能良好的精子百分?jǐn)?shù)（Rh123%）明顯下降，而線粒體功能喪失的精子百分?jǐn)?shù)（PI%）明顯增多，與空白組小鼠比較均有明顯差異（P＜0.05）；經(jīng)“益精方”治療后，線粒體功能逐漸好轉(zhuǎn)，大劑量組小鼠線粒體功能良好的精子顯著性增加（P＜0.05），同時(shí)治療后線粒體功能喪失的精子明顯減少，與模型組小鼠比較有明顯差異（P＜0.05）。

“益精方”是賈金銘主任治療少、弱精子癥的系列方劑之一，在臨床治療中療效可靠[2,3]。根據(jù)中醫(yī)理論，當(dāng)歸為補(bǔ)血活血之圣藥，功用補(bǔ)血活血，調(diào)經(jīng)止痛；菟絲子為傳統(tǒng)男性不育古方“五子衍宗丸”之主藥，入腎填精；紅花與當(dāng)歸合用，瘀去而新生，精血充沛而不滯；桑葚固精縮尿，補(bǔ)腎助陽，益精生子；桑螵蛸滋陰補(bǔ)血，生精潤(rùn)燥；熟地補(bǔ)血滋陰、益精填髓，共同輔佐菟絲子達(dá)到補(bǔ)腎填精的效果。仙靈脾補(bǔ)腎壯陽，益命門之火；肉蓯蓉補(bǔ)腎陽、益精血、暖腰膝；韭菜子補(bǔ)肝腎，暖腰膝，三藥合用，溫養(yǎng)腎陽，使精子活動(dòng)能力增加。黃精、玉竹益氣滋陰，五味子收斂固澀，益氣生津，蒼術(shù)燥濕健脾。全方以當(dāng)歸、菟絲子為君，以紅花為臣輔助當(dāng)歸養(yǎng)血活血化瘀，以熟地、桑葚、桑螵蛸為臣輔助菟絲子以補(bǔ)腎填精，同時(shí)以仙靈脾、肉蓯蓉、韭菜子為臣溫腎助陽以壯腎氣，佐以五味子收斂、蒼術(shù)燥濕健脾，共湊活血養(yǎng)血、補(bǔ)腎生精之功。

現(xiàn)代研究表明，方中藥物能從不同靶點(diǎn)角度改善睪丸、附睪和精子的功能。當(dāng)歸[6]能改善外周循環(huán)，能促進(jìn)細(xì)胞再生和恢復(fù)，對(duì)非特異性和特異性免疫功能均有增強(qiáng)作用；與紅花同用，達(dá)到改善睪丸局部微循環(huán)，促進(jìn)活性氧自由基（reactive oxygen species, ROS）清除，增加精子生成的目的。菟絲子水煎劑能明顯增強(qiáng)黑腹果蠅交配次數(shù)，菟絲子水提物對(duì)ROS所致人精子膜損傷有保護(hù)作用[7]；仙靈脾[8,9]能改善下丘腦-垂體-性腺軸的功能；肉蓯蓉[10-12]能抗氧化抗衰老；韭菜子[13-15]中鐵、鋅、鎂、鈣含量豐富，能抗氧化，增加睪丸、附睪、精囊腺的質(zhì)量；熟地[16,17]能提高單核細(xì)胞的活性，提高機(jī)體抗疲勞、抗衰老及清除自由基的能力；桑葚[18,19]富含鎂、鐵、鋅等微量物質(zhì)，能降低血清總膽固醇、甘油三酯水平，促進(jìn)血液循環(huán)；桑螵蛸[20,21]富含人體必需的8種氨基酸、磷脂，能增強(qiáng)機(jī)體抗疲勞能力，提高睪丸指數(shù)。諸藥合用，從多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)對(duì)男性生殖功能產(chǎn)生作用，促進(jìn)精子生成、改善精子活力，其作用的具體過程尚需進(jìn)一步研究。

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（2014-06-26收稿）

Effects of Yijingfang on mitochondrion in the mouse model of cyclophosphamide-induced oligoasthenospermia

Li Zhu1, Luo Shaobo2, Zhang Jinying2, Jia Jinming3*, Hu Haixiang1
1. Deptment of Rehabilitation Medicine，General Hospital of Air Force PLA, Beijing 100142, China;
2. Department of Andrology, Guang'anmen Hospital South Area; 3. Department of Andrology, Guang'anmen Hospital

Jia Jinming, E-mail: nanke1145@126. com

ObjectiveTo observe the effects ofYijingfangon the mitochondrion in the mouse model of cyclophosphamide-induced oligoasthenospermia.MethodsForty Kunming male mice were randomly divided into four groups such as the control group (CG), the model group (MG), small-doseYijingfanggroup (SG), and large-doseYijingfanggroup of (LG). The mice of CG were intraperitoneally injected with normal saline at 60 mg/kg once a day ,while those of MG, SG and LG with cyclophosphamide, all for 5 days. During the next 34 days, the mice of SG and LG received intragastric administration ofYijingfangonce a day, the former at a dose 2times and the latter 5 times that of human routineusage, those of MG given the same volume of normal saline, and CG normally fed. At 35 days, we measured the sperm count, percentages of grades a+b and a+b+c sperm, and the function of mitochondrion in the epididymal sperm of the mice.ResultsThe sperm counts of CG, MG, SG and LG were(5.20±1.34), (1.73±0.03), (2.08±0.01) and (3.31±0.56)×106/mL, respectively, and sperm number was signif cantly lower in MG than that in CG (P<0.05), but higher in LG than that in MG (P<0.05). The grade a+b sperm constituted (14.49±0.30), (6.64±1.88), (11.99±1.01) and (19.40±3.13)% in CG, MG, SG and LG, respectively, and the grade a+b sperm was remarkably lower in MG than that in CG (P<0.05), but higher in LG than that in MG(P<0.05); the grade a+b sperm accounted for (68.39±15.13), (39.96±4.89), (62.28±4.43) and (73.61±5.05)%, respectively, and it was obviously lower in MG than that in CG (P<0.05) but higher in LG than that in MG (P<0.05); the percentages of good function mitochondrion were (1105.93±0.33)%, (848.55±6.15)%, (888.77±22.46)% and (1000.885 ±72)% in CG, MG, SG and LG, respectively, and it was remarkably lower in MG than that in CG (P<0.05), but higher in LG than that in MG(P<0.05); defuctionalization mitochondrion were (27.94±0.32)%, (42.43±1.00)%, (35.11±1.23)% and (30.91±0.44)%，respectively, it was remarkably higher in MG than that in CG (P<0.05), but obviously lower in LG than that in MG(P<0.05).ConclusionIntraperitoneal injection of cyclophosphamide decreases the sperm count, percentages of grades a+b and a+b+c sperm, and the function of mitochondrion in mice, while large-doseYijingfangcan improve the above parameters, and contributes to the treatment of oligoasthenospermia.

Yijingfang; mitochondria; asthenozoospermia; mice

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.10.003

R 698.2

*通訊作者, E-mail: nanke1145@126. com