短時(shí)授精后受精率高與受精完全失敗后早補(bǔ)救患者的臨床結(jié)局和精子參數(shù)分析*

周 亮 王錦鳳 肖 露 王 勇 耿 嵐 郝桂琴 張 秦 石江霞 錢衛(wèi)平

北京大學(xué)深圳醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科（深圳 518036）

短時(shí)授精后受精率高與受精完全失敗后早補(bǔ)救患者的臨床結(jié)局和精子參數(shù)分析*

周 亮 王錦鳳 肖 露 王 勇 耿 嵐 郝桂琴 張 秦 石江霞 錢衛(wèi)平**

北京大學(xué)深圳醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科（深圳 518036）

目的分析體外授精（IVF）短時(shí)授精中受精率高（受精率＞60%）與受精完全失?。ㄊ芫?0%）早補(bǔ)救卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）患者的臨床結(jié)局和精子參數(shù)，探討IVF失敗的相關(guān)因素。方法對(duì)比322例IVF短時(shí)授精周期中153例受精率達(dá)到60%以上的患者（受精率高組即 A組）與同期接受IVF短時(shí)授精發(fā)現(xiàn)受精完全失敗后進(jìn)行早補(bǔ)救ICSI治療的53名患者（受精完全失敗組即B組）的臨床結(jié)局及其精子參數(shù)。結(jié)果A組與B組各獲卵1 619和393枚，各有133名和47名患者接受了新鮮胚胎移植。兩組間的正常卵裂率分別為98.02%（940/959）和97.70%（254/260），優(yōu)質(zhì)胚胎率分別為33.51%（315/940）和35.43%（90/254），平均移植胚胎數(shù)分別為2.15±0.39和2.05±0.52，移植日內(nèi)膜厚度分別為（12.99±2.53）mm和（12.38±2.45）mm，胚胎種植率分別為29.41%（85/289）和24.73%（23/93），臨床妊娠率分別為44.36%（59/133）和42.55%（20/47），流產(chǎn)率分別為2.26%（3/133）和2.13%（1/47），繼續(xù)妊娠率分別為41.35%（55/133）和38.30%（18/47），差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而A組的正常受精率較B組低[65.55%（959/1463）vs 77.61%（260/335）]，同時(shí)多原核受精率較B組高[14.56%（213/1463）vs 6.27%（21/335）]，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A組與B組平均精子密度分別為（74.63±36.05）×106/ mL和（76.97±36.64）×106/mL，前向精子密度分別為（46.02±13.79）×106/mL和（40.63±16.08）×106/mL，正常形態(tài)精子分別為（3.74±1.73）%和（4.21±1.86）%，頂體酶活性分別為（79.18±24.89）uIU和（71.81±32.30）uIU，均存在一定的差異，但是并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 短時(shí)授精后受精率高與受精完全失敗行早補(bǔ)救患者具有接近的臨床妊娠率，但受精率高組較受精失敗行早補(bǔ)救組具有更高的多原核受精率和更低的正常受精率，前向精子密度和精子形態(tài)對(duì)受精有重要影響，但是其對(duì)受精失敗的預(yù)測(cè)作用有限。

精子注射, 細(xì)胞質(zhì)內(nèi); 妊娠結(jié)局; 精子

常規(guī)體外授精（in vitro fertilization, IVF）周期中完全失敗的發(fā)生率約為5%～10%[1,2]，給醫(yī)患雙方帶來巨大的精神壓力和經(jīng)濟(jì)困難。IVF短時(shí)授精結(jié)合早補(bǔ)救卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）方案的實(shí)施能在IVF受精完全失敗后挽救該治療周期，并取得較好的妊娠結(jié)局，所以逐漸被廣泛應(yīng)用。

在IVF短時(shí)授精早期拆顆粒細(xì)胞后，IVF實(shí)驗(yàn)室工作人員能遇到多種情況，最常見的是可見部分兩極體受精卵，表明部分卵母細(xì)胞受精了，而進(jìn)行早補(bǔ)救ICSI的患者往往在早拆顆粒細(xì)胞后，觀察不到任何卵母細(xì)胞具有兩極體，表明可能IVF完全失敗。本中心進(jìn)行IVF短時(shí)授精治療的患者一般是不孕年限超過4年，或精子密度處于（5～30）×106/mL范圍內(nèi)，或正常精子形態(tài)少于4%，為避免IVF完全失敗而行短時(shí)授精方案，現(xiàn)回顧性分析短時(shí)授精后受精率高（受精＞60%）與受精完全失敗患者的臨床結(jié)局和精子參數(shù)，希望從臨床上尋找與受精失敗相關(guān)的因素，既能避免受精完全失敗又能防止過度治療。

資料與方法

一、研究對(duì)象與分組

回顧性分析2013年1月1日至2014年5月30日期間于我院生殖中心接受IVF短時(shí)授精且受精率＞60%的153個(gè)周期（A組）和53個(gè)短時(shí)授精完全失敗早補(bǔ)救ICSI周期（B組）的臨床結(jié)局和精子參數(shù)?；颊吲降牟辉心晗蕹^4年，或精子密度處于（5～30）× 106/mL范圍內(nèi)，或正常精子形態(tài)少于4%。兩組間患者雙方的年齡、不孕年限、用藥天數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。助孕前，精液檢查采用WHO精液分析方法進(jìn)行2次及以上分析，結(jié)果判斷以WHO檢測(cè)手冊(cè)（第五版）為準(zhǔn)。IVF短時(shí)授精方案是于精卵共孵育4～6h后拆卵并觀察第二極體排出情況，在精卵共孵育16～18h觀察記錄原核情況。A組和B組各有133名和47名患者接受了新鮮胚胎移植。

二、方法

（一）促排方案

患者前一月經(jīng)周期第21天左右給予促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（gonadotropin releasing hormone agonist, GnRH-a，博福-益普生制藥有限公司，3.75mg/瓶）1.25mg 進(jìn)行肌肉注射，根據(jù)患者年齡和雙側(cè)卵巢基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)，在月經(jīng)第4～6d開始給予促性腺激素（gonadotropin, Gn）果納酚（默克雪蘭諾有限公司，75 IU/支）2～6支/d。，當(dāng)2個(gè)或2個(gè)以上卵泡直徑達(dá)18mm時(shí)，肌注人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrop, HCG，麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠，2000IU/瓶）10000IU，36～38h后經(jīng)陰道B超指引下取卵。

（二）常規(guī)精液分析和形態(tài)學(xué)檢查

禁欲3～7d后手淫取精，用Markler計(jì)數(shù)板進(jìn)行精液常規(guī)分析，用Diff-Quick法分析精子形態(tài)，采用改良Kennedy法檢測(cè)頂體酶活性。

（三）精液處理與體外授精

術(shù)前禁欲3～7d，取卵當(dāng)日男方以手淫法取精，液化后采用密度梯度離心法+上游法優(yōu)化精子，加精比例為2～4萬條精子/卵。

（四）授精觀察

在精卵共孵育4h后拆去卵周的顆粒細(xì)胞并移至新的培養(yǎng)滴，觀察卵是否成熟，是否具有兩極體，卵胞漿形態(tài)等[3]。如4h后觀察到有部分卵子具有雙極體，將其繼續(xù)培養(yǎng)至16～18h后觀察記錄原核情況。如4h未觀察到雙極體，于6h再進(jìn)行觀察，如發(fā)現(xiàn)有受精卵具有雙極體則繼續(xù)培養(yǎng)，如仍未觀察到卵子具有雙極體就對(duì)所有MII卵子實(shí)施早補(bǔ)救ICSI并記錄在案。

（五）原核期和卵裂期胚胎觀察

精卵共孵育16～18h后（即取卵后第一天）將胚胎移入卵裂微滴，進(jìn)行原核觀察，看到兩個(gè)清楚的原核即為正常受精，異常受精包括觀察到1個(gè)原核和3個(gè)或以上的原核，未觀察到原核作為未受精記錄。取卵后第三天觀察卵裂情況，按卵裂期胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，主要記錄胚胎細(xì)胞數(shù)、碎片率和卵裂球大小是否均等。優(yōu)質(zhì)胚胎的定義為取卵后第三天為7～9個(gè)卵裂球，大小基本均等，碎片率低于10%。取卵后第三天行新鮮胚胎移植，根據(jù)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)選取2～3個(gè)最優(yōu)胚胎進(jìn)行移植。

（六）確定臨床結(jié)局

移植胚胎14d后行血HCG檢測(cè)，結(jié)果為陽性者于移植后35d行B超檢查，如有孕囊即診斷為臨床妊娠。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/新鮮移植周期數(shù)×100%；胚胎種植率=B超下觀察到的孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%。

（七）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件中卡方檢驗(yàn)和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般資料及精子參數(shù)比較

共納入對(duì)象206例（A組153例，B組53例），其中共計(jì)180例行新鮮胚胎移植（A組133例，B組47例）。兩組患者的年齡、不孕年限、基礎(chǔ)卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone: FSH）、基礎(chǔ)黃體生成素（luteotropic hormone: LH）、基礎(chǔ)雌二醇（Estradiol：E2）、用藥天數(shù)、HCG日FSH、HCG日LH、HCG日E2、移植胚胎數(shù)和移植日內(nèi)膜厚度均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表1。

表1 兩組一般情況及妊娠結(jié)局分析

二、受精情況、胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局比較

A組和B組各獲卵分別為1 916和393枚，正常受精（2原核）率分別為65.55%和77.61%，多原核受精率分別為14.56%和6.27%，正常卵裂率分別為98.02%和97.69%，優(yōu)質(zhì)胚胎率分別為33.51%和35.43%。A組和B組分別有133名和47名患者接受了新鮮胚胎移植，胚胎種植率分別為29.41%和24.73%，臨床妊娠率分別為44.36%和42.55%，流產(chǎn)率分別為2.26%和2.13%，宮外孕率分別為0.85%和 2.13%，繼續(xù)妊娠率分別為41.35%和38.30%。其中A組的正常受精率較B組低，但多原核受精率較B組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其他比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。

三、精子參數(shù)分析

A組和B組男方平均年齡分別為（34.62± 5.17）歲和（33.84±4.17）歲，平均精子密度分別為（74.63±36.05）×106/mL 和（76.97±36.64）× 106/mL，前向精子密度分別為（46.02±13.79）× 106/mL和（40.63±16.08）×106/mL，正常形態(tài)精子百分率分別為3.74 %和4.21%，頂體酶活性分別為（79.18±24.89）uIU和（71.81±32.30）uIU。A組具有更高的前向精子密度，但是兩組比較并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；兩組間的正常精子形態(tài)和頂體酶活性也無顯著差異，見表2。

表2 兩組精子參數(shù)分析（±s）

表2 兩組精子參數(shù)分析（±s）

t值P值男方年齡(歲) 34.62±5.17 33.84±4.17 0.76 0.45精液量(mL) 3.43±1.25 3.25±1.38 0.73 0.46精子密度(106/mL) 74.63±36.05 76.97±36.64 -0.34 0.74前向精子密度(106/mL) 46.02±13.79 40.63±16.08 1.95 0.053正常精子形態(tài)(%) 3.74±1.73 4.21±1.86 -1.37 0.17頂體酶活性(uIU/106） 79.18±24.89 71.81±32.30 1.25 0.22

討 論

IVF短時(shí)授精是指授精后早期將受精卵從精卵共孵育液中移出，拆除顆粒細(xì)胞觀察卵母細(xì)胞是否具有雙極體并以此推斷其受精與否，因該技術(shù)能成功避免完全受精失敗，同時(shí)并沒擴(kuò)大ICSI指征，所以在業(yè)內(nèi)大受歡迎。也有研究表明短時(shí)授精較常規(guī)IVF授精可以使受精卵免受高活性氧（reactive oxygen species, ROS）的影響而提高胚胎質(zhì)量[4,5]。本研究也表明短時(shí)授精能避免受精障礙患者IVF失敗并獲得良好的臨床結(jié)局。

一、 短時(shí)授精增加IVF受精無障礙患者的多原核受精率

伴隨著短時(shí)授精技術(shù)的廣泛使用，在IVF實(shí)驗(yàn)室會(huì)遇到了各種不同情況，部分患者短時(shí)授精完全失敗，這部分患者是短時(shí)授精早補(bǔ)救ICSI技術(shù)的得益者，從以上的數(shù)據(jù)分析結(jié)果可知，早補(bǔ)救后的受精率、正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率，臨床妊娠率都具有較滿意的效果，同時(shí)其多原核受精率，流產(chǎn)率和異位妊娠率也在較低的水平[6]。在應(yīng)用短時(shí)授精技術(shù)時(shí)，還遇到部分患者，其實(shí)際受精能力本無障礙，短時(shí)授精早拆顆粒細(xì)胞后無需補(bǔ)救ICSI，從上面的數(shù)據(jù)分析結(jié)果可知，這部分患者同樣具有較滿意的正常卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率和繼續(xù)妊娠率，但是本研究結(jié)果表明其多原核受精率達(dá)14.56%，顯著高于受精失敗早補(bǔ)救ICSI組，其原因是否與短時(shí)授精早期拆顆粒細(xì)胞操作相關(guān)尚不明了。

二 、精子參數(shù)對(duì)IVF短時(shí)授精結(jié)果的預(yù)測(cè)能力有限

為了既能避免完全受精失敗，又能不過度進(jìn)行短時(shí)授精早拆顆粒細(xì)胞，本研究對(duì)比分析了短時(shí)受精率高組和完全失敗組的各種精子參數(shù)，期望能尋到一定的線索指導(dǎo)臨床工作，研究的結(jié)果顯示兩組間精子密度和總精子數(shù)均相當(dāng)，A組的前向精子數(shù)較受精失敗組高，但是并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；兩組間的正常精子形態(tài)百分率和頂體酶活性也無顯著差異。在臨床工作中，精子正常形態(tài)百分率和頂體酶活性仍是一個(gè)重要的推測(cè)受精能力的指標(biāo)，但是就個(gè)體而言，仍有患者具有較高精子正常形態(tài)百分率和頂體酶活性仍然受精完全失敗，同時(shí)又有部分患者實(shí)際受精無障礙但是其精子正常形態(tài)和頂體酶活性檢測(cè)結(jié)果數(shù)值較低。

哺乳動(dòng)物的自然受精是一個(gè)精密而復(fù)雜的生理過程，它包括了精卵識(shí)別、頂體反應(yīng)、精子穿過透明帶、精卵質(zhì)膜結(jié)合、卵子皮質(zhì)反應(yīng)和雌雄原核形成等一系列的重要步驟，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都可能引起IVF受精失敗[7,8]。在輔助生殖技術(shù)治療過程中，精子質(zhì)量參數(shù)具有重要的預(yù)測(cè)受精能力的作用，但是在常規(guī)IVF授精和IVF短時(shí)授精間界定出明確的界限和指標(biāo)需要更大樣本量的分析，也是業(yè)界的目標(biāo)和努力的方向。

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（2014-08-01收稿）

Clinical outcomes and sperm parameter analysis between patients with high fertilization rate and complete fertilization failure after short co-incubation of gametes combined with early rescue ICSI*

Zhou Liang, Wang Jingfeng, Xiao Lu, Wang Yong, Geng Lan, Hao Guiqing, Zhang Qin, Shi Jiangxia, Qian Weiping**
Department of Reproductive Medicine, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong, China

ObjectiveTo analyze the clinical outcomes and sperm parameters of patents after short co-incubation of gametes combined with early rescue ICSI, and investigate the causes of complete fertilization failure.MethodsAmong 322 short co-incubation of gametes cycles, 153 cases had high fertilization rate (IVF fertilization rate>60%: Group A) and 53 cases had complete un-fertilization and rescued by early ICSI (IVF fertilization rate=0%: Group B). The clinical outcomes and sperm parameters were comparatively analyzed between above two groups.ResultsThe patients in Group A and Group B received (1916 vs 393) eggs, and 133 and 47 patients accepted embryo-transfer in their freshcycles, respectively. There were no signif cant differences in the rates of cleavage[98.02%(940/959)vs 97.70%(254/260)], good quality embryo[33.51%(315/940)vs 35.43%(90/254)], implantation[29.41%(85/289)vs 24.73%(23/93)], clinical pregnancy[44.36%(59/133)vs 42.55%(20/47)], abortion[2.26%(3/133)vs 2.13%(1/47)] and ongoing pregnancy[41.35%(55/ 133)vs 38.30%(18/47)] between two groups. The normal fertilization (2PN) rate in Group A was signif cant lower than that in Group B, and the polyspermy rate was signif cant higher than that in GroupB. The average sperm density (74.63×106/ mL vs 76.97×106/mL), forward movement sperm density (46.02×106vs 40.63×106), normal sperm morphology (3.74% vs 4.21%) and acrosin (79.18 vs 71.81) were difference between above two groups, but the difference was not signif cant.ConclusionThe patients in Group A and Group B presented similar clinical pregnancy rates, but the patients in Group A had higher polyspermy rate and lower normal fertilization (2PN) rate. Forward movement sperm density and sperm morphology showed some effects on fertilization, but accurate prediction of fertilization failure by sperm parameters still needs to be further investigated.

sperm injections, intracytoplasmic; pregnancy outcome; spermatozoa

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.10.006

R321-33

資助: 為國(guó)家自然科學(xué)基金資助（30900817）；深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目資助（201302069, JCYJ20120618, ZYC201006180435A）
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, E-mail: qianweiping2014@163.com