高效液相色譜法測定蒙成藥升陽十一味丸中沒食子酸含量＊

郭寶鳳，王玉華，侯海玲

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學藥學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)

升陽十一味丸由全石榴、益智、紅花、蓽茇、黃精、玉竹、蒺藜、肉桂、天花粉、冬葵果、天冬11 味藥材組方，具有暖腎、利水、消食、燥“協(xié)日烏素”的功效，可用于胃寒、消化不良、腎寒腰疼、寒性腹瀉等癥，臨床應(yīng)用廣泛。其藥品標準收載于1998 年版《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·蒙藥分冊》[1]，現(xiàn)有質(zhì)量標準中沒有含量測定內(nèi)容。筆者建立了測定升陽十一味方中君藥全石榴沒食子酸含量的高效液相色譜(HPLC)法，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

日本L-2000 型高效液相色譜儀，DAD 檢測器，EZChrom Elite for Hitachi Version 工作站;Mettle RAE240 型電子天平(梅特勒-托利多有限公司);28HVLRASOTH 型超聲處理器(昆山市超聲儀器有限公司)。升陽十一味丸(編號A，B，C，內(nèi)蒙古烏蘭浩特中蒙制藥有限公司，批號分別為090214，090701，090313;編號D，E，F(xiàn)，阜新蒙藥有限責任公司，批號分別為20100302，20060224，20100414;編號G，內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司，批號為100537);沒食子酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號為110831 -200302，供含量測定用);甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

稱取沒食子酸對照品適量，精密稱定，置容量瓶中，加甲醇制成每1 mL 含沒食子酸27 μg 的溶液，即得對照品溶液。取樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%乙醇25 mL，超聲處理(功率220 W，頻率40 kHz)30 min，過濾，濾液50 ℃減壓旋干，用25 mL 水分次轉(zhuǎn)入60 mL 分液漏斗中，用醋酸乙酯萃取5 次，每次25 mL，合并萃取液，30 ℃減壓旋干，殘渣用甲醇分次溶解，轉(zhuǎn)移至25mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按照處方比例及制備工藝，取缺全石榴的方中其他藥材粉末，制備陰性對照品，精密稱取適量，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱:菲羅門Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇-0.1%磷酸水溶液(5 ∶95);檢測波長:273 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:10 μL。理論板數(shù)按沒食子酸的峰計算不低于4 000。

2.3 方法學考察

專屬性試驗:分別吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進樣測定，色譜圖見圖1。在沒食子酸對照品色譜峰的保留時間處，供試品溶液有色譜峰且與相鄰峰得到基線分離，陰性照品溶液在此處無色譜峰，說明共存的其他藥味對測定無干擾。

線性關(guān)系考察:精密稱取沒食子酸對照品1.36 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度(質(zhì)量濃度為27.02 μg/mL)，精密吸取2，5，10，15，20 μL，分別注入液相色譜儀中，按擬訂色譜條件測定，記錄色譜圖。以進樣量(X，μg)對峰面積積分值(Y)進行回歸分析，得回歸方程Y=12 095 X-797 509，r=1.000 0(n=5)。結(jié)果表明，沒食子酸進樣量在54.04 ～540.4 ng 范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗:取同一沒食子酸對照品溶液(質(zhì)量濃度為27.02 μg/mL)，進樣10 μL，連續(xù)測定5 次。結(jié)果峰面積平均值為2 188 165，RSD=1.35%(n=5)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品(批號為090701)溶液，分別于制備后0，2，4，6，8，12，24 h 時進樣測定。結(jié)果的RSD=1.89%(n=7)，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復性試驗:取同一批(批號為090701)供試品6 份，每份取樣量約0.5 g，精密稱定，依法制備供試品溶液進樣測定。結(jié)果平均含量為1.288 mg /g，RSD =1.90%(n =6)，表明方法重復性良好。

圖1 專屬性試驗高效液相色譜圖

加樣回收試驗:取已知含量的供試品(批號為090701，沒食子酸含量為1.288 mg/g)粉末約0.25 g，精密稱定，共9 份，分別加入沒食子酸對照品0.259 4，0.324 2，0.389 1 mg，各3 份。分別按供試品溶液制備方法制備溶液，按擬訂色譜條件測定，記錄色譜圖，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 沒食子酸加樣回收試驗結(jié)果(n=9)

2.4 樣品含量測定

取7 個批次的供試品各0.5 g，依法制備供試品溶液，進樣10 μL，按擬訂色譜條件測定，計算含量。結(jié)果見表2。可見，樣品中沒食子酸的含量為0.5344 ～1.349 mg/g，不同廠家之間存在差異，相同廠家的不同批次間也有差異。因此，對君藥全石榴中沒食子酸進行含量測定具有現(xiàn)實意義。

3 討論

流動相的選擇:2010 年版《中國藥典(一部)》[1]及文獻[2-3]測定沒食子酸所采用的流動相為不同比例的甲醇-磷酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液(含0.1%三乙胺)。經(jīng)試驗篩選，選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液(5 ∶95)為流動相。

檢測波長的選擇:2010 年版《中國藥典(一部)》及文獻[4-7]中采用HPLC 法測定單藥材及成方制劑中沒食子酸的含量，所用檢測波長有216，273，267，275 nm。本試驗中，在200 ～800 nm 波長范圍內(nèi)對沒食子酸對照品溶液進行光譜掃描。結(jié)果光譜圖中有2 個吸收峰，波長分別為220，273 nm。考慮在220 nm 波長為末端吸收、干擾較多，273 nm 波長處的峰高且相對較銳，故選擇273 nm為測定波長。

表2 樣品含量測定結(jié)果(n=2)

超聲時間的選擇:分別考察了不同超聲提取時間對沒食子酸含量的影響。結(jié)果表明，超聲30 min 與20 min 比較，隨著超聲時間的延長，含量明顯提高;超聲30 min 與40 min 比較，兩者含量沒有明顯的變化。故確定超聲時間為30 min。

萃取次數(shù)的選擇:該方由全石榴等10 味藥組方，全石榴為君藥，沒食子酸又為其主要成分[8]，故以沒食子酸為指標性成分進行含量測定[9]。但含量測定時干擾成分較多，故在前處理時增加了萃取步驟。選用乙酸乙酯進行萃取并對萃取次數(shù)進行考察，結(jié)果表明，隨著萃取次數(shù)的增加，沒食子酸含量增加;萃取5 次與萃取4 次的結(jié)果比較，前者的含量明顯增高，但與萃取6 次的結(jié)果比較時含量沒有明顯變化。故確定用乙酸乙酯萃取5 次。

柱耐用性試驗:為了考察不同ODS 柱(型號和柱效均不同)對測定結(jié)果的影響，選用3 種型號的色譜柱對同一供試品(批號為20100414)溶液進行測定。結(jié)果顯示，沒食子酸峰與相鄰峰均能達到基線分離，峰對稱性均好，且各柱含量測定結(jié)果之間沒有明顯差異，說明色譜柱理論塔板數(shù)在3 000 以上時柱型號對結(jié)果沒有影響。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(一部)[M]. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:173.

[2] 霍 文，劉占軍，張婷婷. 反相高效液相色譜法測定石榴皮中沒食子酸的含量[J]. 西北藥學雜志，2007，22(5):242 -243.

[3] 王克英. 石榴皮中沒食子酸定性定量方法研究[J]. 中國中藥雜志，2005，30(15):1 171 -1 172.

[4] 許 勇，郟征偉，諸艷蓉，等.HPLC 法測定扎沖十三味丸中沒食子酸的含量[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2012，22(7):1 560 -1 561.

[5] 霍生青.HPLC 測定十三味菥冥丸中的沒食子酸[J]. 華西藥學雜志，2012，27(4):100 -101.

[6] 張朔生.HPLC 測定炮制前后石榴皮中沒食子酸的含量[J]. 藥物分析雜志，2010，30(6):137 -139.

[7] 林 夏，胡軍華，崔培超，等.HPLC 同時測定大花紅景天提取物中沒食子酸、紅景天苷、酪醇、對香豆酸的含量[J]. 中國實驗方劑學雜志，2013，10(19):102 -105.

[8] 張 倩，杜海云，陳令梅，等. 石榴化學成分及其生物活性研究進展[J]. 落葉果樹，2010(6):17 -22..

[9] 劉 源，沈好文. 高效液相色譜法測定化痔靈片中沒食子酸含量[J].中國藥業(yè)，2013，22(8):56 -58.