羅衛(wèi)民 劉越峰 羅湘玉 張 軍▲
1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院心胸外科,湖北十堰 442000;2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市人民醫(yī)院眼科,湖北十堰 442000
阿霉素 (Doxorubicin,DOX) 是一種廣泛應(yīng)用于腫瘤治療的蒽環(huán)類抗生素。盡管其對(duì)包括白血病在內(nèi)的多種惡性腫瘤具有抑制作用,但其蓄積性不可逆性心肌病以及充血性心衰限制了其使用[1]。 DOX 導(dǎo)致的毒性心肌病原因很多, 其中活性氧 (reactive oxygen species,ROS) 介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡是其重要機(jī)制之一[2]。 因此,在DOX 治療的同時(shí)預(yù)防性使用抗氧化藥物干預(yù),有望降低其副作用[3]。 近年來(lái),某些藥用植物在心血管疾病的預(yù)防過(guò)程中具有一定的預(yù)防作用[4],金櫻子為薔薇科金櫻子(Rosa Laevigata Michx.,RLM)的果實(shí),研究發(fā)現(xiàn)它具有強(qiáng)大的抗氧化和清除自由基能力[5-6]。本研究旨在觀察RLM 對(duì)DOX 誘發(fā)的心臟毒性的保護(hù)作用。
DOX 購(gòu)自意大利Pharmacia 公司(批號(hào):8NB002-A), 血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (aspartate transaminase,AST)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Quimica Clinica Aplicada。 血清總膽固醇(total cholesterol,TC)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)和肌酸激酶(creatine kinase,CKMB)試劑盒為Stanbio 產(chǎn)品。還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)及丙二醛(myocardial lipid peroxide,MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物技術(shù)研究所。心肌腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor-alpha,TNF-α)ELISA 試劑盒和caspase-3 的比色測(cè)定試劑盒購(gòu)自Quantikine。 分析純?cè)噭┲饕?gòu)自Sigma-Aldrich 公司。
金櫻子購(gòu)于十堰市中草藥材公司,經(jīng)去籽后用煎藥機(jī)進(jìn)行熬煎。金櫻子的鑒定由湖北醫(yī)藥學(xué)院肖勝全教授完成,其提取液濃度為2.0 g/mL。
成年雄性Wistar 大鼠由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供,體重(250±5)g,在SPF 環(huán)境下給予標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室的水和食物飼養(yǎng)2 周。 大鼠隨機(jī)分成5 組:空白對(duì)照組(8 只),大鼠接受等體積的生理鹽水作為陰性對(duì)照;DOX 模型組(15 只), 大鼠連續(xù)兩周每間隔48 h注射DOX(2.5 mg/kg,ip)共6 次,使其累積劑量達(dá)15 mg/kg。RLM 高、中、低劑量組(每組各30 只):在DOX模型組的基礎(chǔ)上,大鼠每日給予RLM(1、2、5 g/kg)灌胃,DOX 停止后,持續(xù)RLM 灌胃4 周。
大鼠處理結(jié)束后, 獲取血液標(biāo)本,8000×g 離心10 min 獲取血清用于測(cè)定TC、AST、LDH 和CK-MB。隨后解剖大鼠,分離心臟,生理鹽水漂洗2 次。 將心臟組織剪切,制備成20%的勻漿后,二喹啉甲酸法測(cè)定其總蛋白濃度及AST、LDH、CK-MB 活性、TC 水平(mg/dL)。
心臟勻漿與等體積2.3%的KCl 混合,600×g,4℃離心15 min,獲取上清用于測(cè)定MDA。其原理基于脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物與硫代巴比妥酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng),生成粉紅色的有色絡(luò)合物,從而用分光光度計(jì)以四甲氧基丙烷為標(biāo)準(zhǔn)品,532 nm 和520 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量其OD值。 結(jié)果用nmol/mg 表示。
將等體積的心臟勻漿和預(yù)冷7.5%5-磺酸基水楊酸緩沖液以沉淀蛋白。隨后4℃,600×g 離心10 min,獲取上清用于測(cè)量還原型GSH。 其原理基于還原型GSH能與5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)反應(yīng),產(chǎn)物在421 nm波長(zhǎng)處能形成最大吸收峰。 含量用mg/g 組織表示。
50 mg 心肌組織加入0.8 mL pH 7.4 的裂解緩沖液中制成勻漿,10 000×g,4℃離心15 min。 獲取上清用于TNF-α 和caspase-3 測(cè)定。 其中TNF-α 根據(jù)試劑盒提供的步驟進(jìn)行,采用固相夾心ELISA 法,四甲基聯(lián)苯胺(TMB)法顯色并于450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量其吸光度,用pg/mg 蛋白表示。 采用間接法測(cè)定caspase-3活性,基于caspase-3 切除底物分子DEVD-pNA 中的發(fā)光基團(tuán)pNA,隨后在405 nm 處用測(cè)量其吸光度,用OD 值表示,從而間接反應(yīng)其活性。
應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,并采用單因素方差分析數(shù)據(jù),行t 檢驗(yàn),以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
心臟功能和血脂參數(shù)顯示,DOX 注射后, 血清AST、LDH、CK-MB、TC 水平顯著增高。 而同時(shí)給予RLM 干預(yù)后,這些參數(shù)隨著RLM 濃度的增高而不斷改善,見(jiàn)表1。
表1 不同濃度金櫻子處理對(duì)阿霉素心肌損傷大鼠血生化指標(biāo)的影響(±s)
表1 不同濃度金櫻子處理對(duì)阿霉素心肌損傷大鼠血生化指標(biāo)的影響(±s)
注:與空白對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與DOX 模型組比較,#P <0.05;AST:血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶;LDH:乳酸脫氫酶;TC:血清總膽固醇;CK-MB:肌酸激酶;RLM:金櫻子;DOX:阿霉素
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與空白對(duì)照組相比,DOX 處理組能誘導(dǎo)心肌MDA明顯增加(P<0.01),給予不同濃度RLM 處理后,心肌MDA 含量隨之降低,其中DOX+5 g/kg RLM 處理后,MDA 含量降低最多[(0.82±0.14) nmol/mg]。 見(jiàn)圖1。
圖1 RLM 對(duì)血清丙二醛含量的影響
與空白對(duì)照組相比,DOX 組大鼠血清總GSH 含量顯著降低(P < 0.01)。而同時(shí)給予不同濃度RLM 處理后,GSH 含量隨之升高。 5 g/kg RLM 處理大鼠后,GSH 含量[(1.06±0.11) pg/g]接近對(duì)照組水平(圖2)。
圖2 RLM 對(duì)血清還原型谷胱甘肽含量的影響
空白對(duì)照組大鼠血清中TNF-α 含量較低,DOX處理后TNF-α 顯著增高(P <0.01)。 RLM 干預(yù)能以劑量依賴性方式降低血清中TNF-α 的含量, 其中DOX+5 g/kg RLM 處 理 后,TNF-α 含 量 降 低 最 多[(3.49±0.05) pg/mg],見(jiàn)圖3。
圖3 RLM 對(duì)血清TNF-α 含量的影響
DOX 處理后,caspase-3 活性增加了近50%。 同時(shí)經(jīng)1~5 g/kg RLM 處理后,caspase-3 活性逐漸降至正常水平, 其中DOX+5 g/kg RLM 處理后,caspase-3活性降低最多(0.83±0.02)。 見(jiàn)圖4。
圖4 RLM 對(duì)caspase-3 活性的影響
DOX 是一種抗腫瘤抗生素,可抑制RNA 和DNA的合成,對(duì)RNA 的抑制作用最強(qiáng),抗瘤譜較廣,對(duì)多種腫瘤均有作用,屬周期非特異性藥物,對(duì)各種生長(zhǎng)周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用。主要適用于急性白血病, 對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病及粒細(xì)胞白血病均有效,一般作為第二線藥物,即在首選藥物耐藥時(shí)可考慮應(yīng)用此藥。 惡性淋巴瘤, 可作為交替使用的首選藥物。DOX 和其他奎寧蒽環(huán)類藥物一樣, 主要的毒性反應(yīng)有: 白細(xì)胞和血小板減少,60%~80%的患者可發(fā)生;100%的患者有不同程度的毛發(fā)脫落, 停藥后可以恢復(fù)生長(zhǎng);心臟毒性,表現(xiàn)為心律失常,ST-T 改變,多出現(xiàn)在停藥后的1~6 個(gè)月[7]。本研究通過(guò)DOX 建立心肌毒性模型發(fā)現(xiàn),血清AST、LDH 和CK-MB 顯著增加,這可能是由于DOX 損傷心肌細(xì)胞膜后,AST、LDH 和CK-MB 漏出所致。 本研究還發(fā)現(xiàn),DOX 還可以導(dǎo)致TC 含量增高,這可能是由于DOX 導(dǎo)致腎病綜合征所致[8]。 RLM 屬薔薇科薔薇屬常綠蔓性灌木野生果樹,其果實(shí)中總糖含量達(dá)24%,其中多糖含量約為金櫻子果實(shí)的8.73%。 研究顯示,RLM 的抗氧化能力與丁基羥基甲苯相當(dāng), 并能顯著清除超氧陰離子自由基、抑制羥自由基對(duì)細(xì)胞膜的破壞而引起的溶血和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的形成,從而具有顯著的抗氧化作用[9]。 此外,RLM 金櫻子能減輕糖尿病腎病大鼠的氧化損傷,減少過(guò)氧化質(zhì),升高抗氧化酶活性,機(jī)制可能與干預(yù)氧化應(yīng)激、抑制核因子-κB、TNF-α 表達(dá)有關(guān)。 本研究顯示通過(guò)RLM 灌胃后, 大鼠的血清指標(biāo)得到了顯著的改善[10-13]。 同時(shí),本研究還觀察了RLM 對(duì)氧化應(yīng)激的影響。 結(jié)果發(fā)現(xiàn),DOX 能顯著增加心肌中MDA 含量,同時(shí)顯著降低GSH 水平。 這可能是DOX 導(dǎo)致氧化應(yīng)激,大量氧自由基的產(chǎn)生導(dǎo)致GSH 減少。 脂質(zhì)過(guò)氧化導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷后引起AST、LDH 和CK-MB漏出至循環(huán)系統(tǒng)是由于心臟損傷[14]。 口服RLM 能明顯降低脂蛋白過(guò)氧化物酶而提高GSH,這表明這些藥物能清除自由基和減少細(xì)胞損傷。 另一方面,氧化應(yīng)激可激活p38 絲裂原激活的蛋白激酶和核因子-κB,從導(dǎo)致TNF-α 大量合成, 反過(guò)來(lái)加重氧化應(yīng)激狀態(tài)而使線粒體膜通透性發(fā)生改變,隨后導(dǎo)致自由基和細(xì)胞色素C 從線粒體中釋放到細(xì)胞質(zhì), 激活caspase-3而引起凋亡發(fā)生[15-17]。 RLM 可能通過(guò)抑制組織中的應(yīng)激反應(yīng)而降低心肌中TNF-α 和caspase-3 含量。
總之,本研究證實(shí)RLM 對(duì)DOX 導(dǎo)致的心肌損傷有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與抗氧化、抗炎和抗凋亡有關(guān)。 在下一步研究中,筆者將對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探討。
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