索骨丹總蒽醌和鞣質(zhì)對細(xì)胞因子的影響

王曉梅，趙 巖，樊曉娜，劉 丹，楊春娟，劉 帆

（1.寶雞文理學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，陜西 寶雞721013；2.寶雞市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 寶雞721001）

索骨丹，又名秤桿七、老蛇盤、鬼燈檠、老漢求等，為虎耳草科索骨丹屬植物索骨丹（Rodgersia aesculifolia Batal.）的根莖，系陜西秦嶺山中的民間藥物。性味：澀，苦，微甘，平。功效：健脾燥濕，收斂固澀，止血，止瀉，止帶。用于濕阻脾胃、運化失司所致的納呆、腹脹、腹瀉、白帶，外傷出血、衄血，吐血、崩漏、脫肛、子宮脫垂，風(fēng)濕筋骨痹痛、咽喉腫痛等癥，單用或配伍使用。由于治療范圍廣，在秦嶺當(dāng)?shù)貞?yīng)用較多［1－3］。索骨丹所含化學(xué)成分包括矮茶素、蒽醌、鞣質(zhì)、黃酮、糖類等。作者就索骨丹總蒽醌和鞣質(zhì)提取物對人單核細(xì)胞受脂多糖刺激后產(chǎn)生和釋放致炎細(xì)胞因子（IL－1β、IL－6、TNF－α）的影響，探討其對炎癥性疾病和免疫反應(yīng)性疾病治療的部分機制，為秦嶺民間藥材的深入開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

索骨丹，購自太白山，經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院胡本祥教授鑒定。

人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞THP－1、THP－1專用培養(yǎng)基（含1640、10%FBS＋b－巰基乙醇、青霉素、鏈霉素）；胰蛋白酶（Solon Ind.Pkwy）；Human TNF－αELISA試劑盒、Human IL－1βELISA試劑盒、Human IL－6 ELISA試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；脂多糖（LPS），科奧生物工程有限責(zé)任公司。

Galaxy 170S型CO2培養(yǎng)箱，德國Eppendorf公司；SW－CJ－2D型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；Power Wave XS2型連續(xù)波長酶標(biāo)儀，美國Bio Tek公司；R－1002型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；Advantage A10型超純水器，美國Merck Millipore公司；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；800B型離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 索骨丹總蒽醌和鞣質(zhì)的提取

1）稱取粉碎的索骨丹50g，按固液比1∶10（g∶mL，下同）溶于80%乙醇中，于45℃超聲提取30 min，倒出上清液，沉渣再次提取，合并2次上清液，離心10min，將上清液濃縮至浸膏狀，用等體積氯仿萃取2次，棄去沉淀和氯仿層，取上層干燥即得索骨丹總蒽醌粉末。

2）稱取粉碎的索骨丹50g，按固液比1∶20溶于95%乙醇中，于50℃超聲提取40min，倒出上清液，沉渣再次提取，合并2次上清液，抽濾，棄去殘渣，將濾液減壓蒸餾，餾分即為鞣質(zhì)粗液；加入等體積乙醚萃取，分出水液層，再用等體積乙酸乙酯萃取，棄去沉淀，水液層及乙酸乙酯層經(jīng)減壓濃縮即得索骨丹鞣質(zhì)。

1.2.2 THP－1細(xì)胞培養(yǎng)

THP－1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的THP－1專用培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，72h換液傳代1次，取第5～15代細(xì)胞進行實驗。將單核細(xì)胞接種于6孔板，每孔約106～107個細(xì)胞，加入含10%胎牛血清培養(yǎng)基5mL，含藥組加入藥物培養(yǎng)24h，加入脂多糖，繼續(xù)培養(yǎng)12h，收集培養(yǎng)液上清待檢測。

細(xì)胞處理及分組：（1）脂多糖組：加入脂多糖溶液，終濃度100ng·mL－1。（2）含藥組：加入脂多糖溶液，終濃度100ng·mL－1；蒽醌溶液及鞣質(zhì)溶液濃度分別為0.50mg·mL－1、0.75mg·mL－1、1.00mg·mL－1、1.25mg·mL－1及1.50mg·mL－1。（3）對照組：加入與脂多糖等體積的培養(yǎng)基。

1.2.3 培養(yǎng)液中細(xì)胞因子的檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）方法檢測，嚴(yán)格按照ELISA檢測試劑盒說明書進行操作，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定450nm處各孔的吸光度值。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 索骨丹總蒽醌對細(xì)胞因子產(chǎn)生和釋放的影響（表1）

表1 索骨丹總蒽醌對細(xì)胞因子產(chǎn)生和釋放的影響Tab.1 The effects of anthraquinones fromRodgersia aesculifolia Batal.on the producing and releasing of cytokines

由表1可知：索骨丹總蒽醌對IL－1β、IL－6和TNF－α的產(chǎn)生和釋放均有不同程度的抑制作用。當(dāng)索骨丹總蒽醌濃度為0.50mg·mL－1時，其對IL－1β具有抑制作用，但無統(tǒng)計學(xué)意義，當(dāng)濃度在0.75～1.50mg·mL－1范圍時，其抑制作用具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；索骨丹總蒽醌對IL－6的作用同樣是低濃度（0.50mg·mL－1，0.75mg·mL－1）時雖有抑制作用，但無統(tǒng)計學(xué)意義，而當(dāng)濃度在1.00～1.50mg·mL－1范圍時，抑制作用具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；索骨丹總蒽醌各濃度對TNF－α均有顯著性抑制作用（P＜0.05）。由表1還可知，索骨丹總蒽醌對TNF－α的抑制作用最強，對IL－1β的抑制作用次之，而對IL－6的抑制作用最弱。

2.2 索骨丹鞣質(zhì)對細(xì)胞因子產(chǎn)生與釋放的影響（表2）

由表2可知，索骨丹鞣質(zhì)各濃度均對TNF－α的產(chǎn)生和釋放具有顯著性抑制作用（P＜0.05）。

實驗還發(fā)現(xiàn)，索骨丹鞣質(zhì)對IL－1β和IL－6也有一定的抑制作用，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 索骨丹鞣質(zhì)對細(xì)胞因子TNF－α產(chǎn)生與釋放的影響Tab.2 The effects of tannins fromRodgersia aesculifolia Batal.on the producing and releasing of cytokine TNF－α

2.3 討論

單核細(xì)胞來源于骨髓中的造血干細(xì)胞，在血液中停留2～3d后遷移到周圍組織中，繼續(xù)發(fā)育成為成熟的細(xì)胞。組織中的單核細(xì)胞稱為組織巨噬細(xì)胞，單核巨噬細(xì)胞膜外有被脂多糖識別并結(jié)合的受體，當(dāng)脂多糖與受體結(jié)合后，即活化細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)區(qū)域，激活了的單核組織細(xì)胞能生成并釋放多種細(xì)胞毒素、干擾素和白細(xì)胞介素，參與機體防衛(wèi)機制。此外，由于脂多糖的作用持續(xù)存在，進一步加強上述過程，從而出現(xiàn)正反饋調(diào)節(jié)［4］。

細(xì)胞因子是由多種細(xì)胞所分泌的小分子多肽的統(tǒng)稱，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化、調(diào)節(jié)免疫功能及參與炎癥發(fā)生和創(chuàng)傷愈合等。現(xiàn)已確認(rèn)的致炎細(xì)胞因子主要有TNF－α、IL－1β和IL－6等，這些細(xì)胞因子在生物損傷的病理過程中扮演重要的角色［5－6］。TNF－α來源廣泛，體內(nèi)的多種細(xì)胞，如單核巨噬細(xì)胞可通過脂多糖、細(xì)菌、病毒等刺激因素產(chǎn)生和釋放TNF－α。TNF－α除具有強大的抗腫瘤作用外，還能促進IL－1、IL－2、IL－6的產(chǎn)生及分泌，誘發(fā)炎癥反應(yīng)。過量的TNF－α可破壞機體的免疫平衡，與其它炎癥因子共同產(chǎn)生多種病理損傷。Ferrari等研究表明，腫瘤壞死因子系統(tǒng)與其它細(xì)胞因子共同構(gòu)成了一個復(fù)雜的免疫網(wǎng)絡(luò)，參與了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強脊炎、糖尿病等多種自身免疫性疾病的發(fā)生及發(fā)展［7］。IL－1在體內(nèi)細(xì)胞來源廣泛，幾乎各種有核細(xì)胞都能產(chǎn)生IL－1。IL－1β主要由活化的單核吞噬細(xì)胞產(chǎn)生［8］。IL－1生物學(xué)效應(yīng)非常重要的方面是參與炎癥反應(yīng)，會引發(fā)全身性癥狀如發(fā)熱、肌消耗和急性期蛋白的合成，在局部時則引起組織炎癥和破壞性病變［9］。IL－6是參與免疫調(diào)節(jié)和炎性反應(yīng)的重要細(xì)胞因子之一，是宿主對感染和組織損傷所引起反應(yīng)的主要介質(zhì)。病毒、細(xì)菌感染均能誘導(dǎo)體內(nèi)IL－6表達(dá)增加［10］。

實驗中，索骨丹總蒽醌對IL－1β、IL－6和TNF－α的產(chǎn)生和釋放均有不同程度的抑制作用，其中各濃度的總蒽醌對TNF－α均有抑制作用，且抑制程度強于對IL－1β、IL－6的作用。當(dāng)總蒽醌濃度較低時，其對IL－1β、IL－6的抑制作用無顯著性差異，濃度較高時抑制作用具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明其作用與藥物濃度具有一定的關(guān)系。索骨丹鞣質(zhì)各濃度對TNF－α具有很強的抑制作用，而對IL－6和IL－1β的抑制作用較弱且無統(tǒng)計學(xué)意義。索骨丹治療范圍廣，在治療慢性消化系統(tǒng)疾病（如潰瘍性結(jié)腸炎）及風(fēng)濕性疾病中使用較多，而這些疾病的發(fā)病機制中都存在IL－1β、IL－6和TNF－α表達(dá)過高的情況，索骨丹的治療作用可能部分是通過抑制炎癥細(xì)胞因子的釋放，進而減輕病變局部急慢性炎癥反應(yīng)、降低對組織的破壞、控制組織慢性增生而實現(xiàn)的。由此推斷，其健脾燥濕、除痹止痛等功能可能對應(yīng)地包括了對以上幾種細(xì)胞因子的抑制作用。索骨丹所含化學(xué)成分復(fù)雜，其對炎癥性疾病的療效可能是某種成分發(fā)揮主要的作用，也可能是多種有效成分相互作用的結(jié)果，其確切的治療機制還需要進行大量研究才能得以明確。

3 結(jié)論

觀察索骨丹總蒽醌和鞣質(zhì)對3種致炎細(xì)胞因子（IL－1β、IL－6、TNF－α）的影響，進而探討其治療炎癥性疾病的部分機制。將體外培養(yǎng)的人單核細(xì)胞分為脂多糖組、不同濃度的含藥組及陰性對照組。除對照組外，各組均加入相同量的脂多糖后繼續(xù)培養(yǎng)12h，收集上清液，采用ELISA法通過酶標(biāo)儀測得各組溶液的吸光度值，再計算出各組細(xì)胞因子的濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：索骨丹總蒽醌除0.50mg·mL－1組外，0.75～1.50mg·mL－1各組均能降低IL－1β含量（P＜0.05）；索骨丹總蒽醌在1.00～1.50mg·mL－1范圍時可降低IL－6含量（P＜0.05）；索骨丹總蒽醌各濃度對TNF－α均有顯著性抑制作用（P＜0.05）。索骨丹鞣質(zhì)各濃度對TNF－α均有顯著性抑制作用（P＜0.05）。表明，索骨丹提取物可通過減少IL－1β、IL－6和TNF－α的產(chǎn)生和釋放而發(fā)揮治療作用。

［1］寶雞市衛(wèi)生局.太白山本草志［M］.西安：陜西科學(xué)技術(shù)出版社，1987：409－410.

［2］中華人民共和國國家藥典委員會.中國藥典（一部）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1977：473.

［3］沈舒文，宇文亞，王萍麗.索骨丹對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠療效及ESR、CRP、RF、IgG、IgM的影響［J］.中華中西醫(yī)臨床雜志，2004，4（1）：47－49.

［4］丁寧，姜勇.細(xì)菌脂多糖識別系統(tǒng)［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2007，23（9）：711－717.

［5］WILSON M R，CHOUDHURY S，TAKATA M.Pulmonary inflammation induced by high－stretch ventilation is mediated by tumor necrosis fasis signaling in mice［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2005，288（4）：L599－L607.

［6］卞建民，王書奎，江濱，等.多種細(xì)胞因子監(jiān)測對嚴(yán)重感染患者的意義［J］.中國危重病急救醫(yī)學(xué)，2002，14（6）：353－355.

［7］MAIAI S R.Infliximab treatment of rheumatoid arthritis［J］.Rheum Dis Clin North Am，2004，30（2）：329－347.

［8］龔非力.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)［M］.第二版.北京：科學(xué)出版社，2004：72.

［9］MOOS V，RUDWALEIT M，HERZOG V，et al.Association of genotypes affecting the expression of interleukin－1beta or interleukin－1receptor antagonist with osteoarthritis［J］.Arthritis Rheum，2001，44（11）：2417－2422.

［10］GAUDINO M，ANDREOTTI F，ZAMPARELLI R，et al.The－174G／C interleukin－6polymorphism influences postoperative interleukin－6levels and postoperative atrial fibrillation.Is atrial fibrillation an inflammatory complication？［J］.Circulation，2003，108（9）：195－199.