頭痛寧口罩的制備和質(zhì)量控制

董 艷， 潘渭樵， 胡一莉， 柏平華， 吳永江

(1. 浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州310058;2. 浙江省湖州市長興縣中醫(yī)院，浙江長興313100;3. 浙江省湖州市藥品檢驗(yàn)所，浙江 湖州313000;4. 浙江省湖州市長興縣衛(wèi)生局，浙江 長興313100)

偏頭痛是一種臨床常見的慢性神經(jīng)血管性疾患［1］，超過1/2 的偏頭痛患者的頭痛會(huì)影響工作或?qū)W習(xí)，近1/3 的患者可因頭痛而誤工或者缺課。世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布的2001 年世界衛(wèi)生報(bào)告將常見疾病按健康壽命損失年進(jìn)行排列，偏頭痛位列前20 位，并將嚴(yán)重偏頭痛定為最致殘的慢性疾病，類同于癡呆、四肢癱瘓和嚴(yán)重精神病［2］。

中醫(yī)認(rèn)為偏頭痛屬于“偏頭風(fēng)”、“額角上痛”、“頭半邊痛”、“頭角痛”或“厥頭痛”等范疇［3-5］。引起偏頭痛的病因主要有感受外邪和內(nèi)傷不足，且以內(nèi)傷為多見。肝陽化風(fēng)，痰瘀阻竅，氣血虧損，肝腎不足為偏頭痛的主要病理機(jī)制［6-7］。中醫(yī)理論認(rèn)為，選擇芳香揮發(fā)性中藥刺激鼻部，通過官竅吸收，作用于經(jīng)絡(luò)、血脈及臟腑，可以起到通調(diào)全身臟腑氣血的作用，達(dá)到治療全身疾病的目的［8］。本研究選擇若干祛風(fēng)行氣的中藥，制成頭痛寧口罩，并進(jìn)行質(zhì)量研究。

1 材料和儀器

1.1 材料 川芎、白芷、當(dāng)歸、細(xì)辛和冰片購自浙江省長興縣中醫(yī)院中藥房。經(jīng)浙江大學(xué)中藥研究所吳永江教授鑒定川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort. 的干燥根莖，白芷為傘形科植物白芷Angelica dahurica (Fisch.ex Hoffm.)Benth. et Hook. f 的干燥根，當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis (Oliv.)Diels 的干燥根，細(xì)辛為馬兜鈴科植物北細(xì)辛Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var. mandshuricum (Maxim.)Kitag. 的干燥根和根莖，冰片為中藥冰片Dryobalanopsaromatica Gwaertn. f.。川芎對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)0918-200004)、阿魏酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)0773-9910)。歐前胡素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110756-200110);甲醇為色譜純(北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司)，水為純化水。

1.2 儀器 RT-02A 型靜音粉碎機(jī)(北京維博創(chuàng)機(jī)械設(shè)備有限公司);Leica DM2500 生物顯微鏡;高效液相色譜儀:Agilent 1200 series，包括四元泵(G1311A)帶真空脫氣機(jī)(G1322A)，自動(dòng)進(jìn)樣器(G1329A)，柱溫箱(G1316A)，紫外檢測器 (G1314A)，Chemstation 色譜工作站 (美國Agilent 公司);電子天平(AR140C，美國OHAUS 儀器有限公司);超聲波清洗器(KUDOS，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。

2 方法和結(jié)果

2.1 口罩的制備 分別取當(dāng)歸、川芎、白芷、細(xì)辛、冰片適量，使用粉碎機(jī)以2 500 r/min 的速度粉碎15 min，收取通過六號(hào)篩且不通過七號(hào)篩的粉末。分別取當(dāng)歸粉末40 g、川芎粉末33 g、白芷粉末20 g、細(xì)辛粉末6 g、冰片粉末1 g，混合均勻，裝入空白口罩的夾層內(nèi)，每個(gè)口罩的裝量為5.0 g，密閉包裝即得。共制備3 個(gè)批次，批號(hào)分別為20111212，20120507，20121010。

2.2 鑒別

2.2.1 薄層色譜 取頭痛寧口罩2 個(gè)，取出中藥粉末，加乙醚20 mL，超聲處理10 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)右掖? mL 使其溶解，作為供試品溶液。另取缺川芎的中藥粉末、川芎對照品、阿魏酸對照品同法處理，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，點(diǎn)樣量為10 μL，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(4 ∶1)為展開劑，在密封的展開缸中展開約1 h，取出，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果如圖1 所示。供試品各斑點(diǎn)分離良好，缺川芎的中藥粉末未出現(xiàn)川芎的特征性斑點(diǎn)。

圖1 薄層色譜鑒別結(jié)果

2.2.2 顯微鑒別 取藥物粉末少許，制片，置顯微鏡下觀察，可見當(dāng)歸的梯紋導(dǎo)管，紡錘形韌皮薄壁細(xì)胞，壁略厚，表面有極微細(xì)的斜向交錯(cuò)紋理;可見川芎的導(dǎo)管呈螺紋，淀粉粒呈橢圓形、長圓形，臍點(diǎn)點(diǎn)狀、長逢?duì)罨蛉俗譅?草酸鈣晶體存在于薄壁細(xì)胞中，呈類圓形或類簇晶狀;可見川芎的木栓細(xì)胞呈深黃棕色，多角形，壁薄，具體如圖2 所示。

圖2 顯微鑒別結(jié)果

2.3 檢查

2.3.1 粒度 照《中國藥典》粒度檢查法第二法測定［9］，結(jié)果通過六號(hào)篩的粉末質(zhì)量平均為97%，符合要求。

2.3.2 均勻度 取頭痛寧口罩6 個(gè)，取出中藥粉末，置光滑紙上，平鋪約5 cm2，將其表面壓平，在明亮處觀察，樣品色澤均勻，無色斑和花紋。

2.3.3 水分測定 取頭痛寧口罩6 個(gè)，取出中藥粉末，照《中國藥典》2010 年版水分測定第二法［9］即甲苯法測定頭痛寧中藥包的含水量，測得平均含水量為7%，符合要求。

2.3.4 裝量差異 取頭痛寧口罩10 個(gè)，分別精密稱定每個(gè)口罩的質(zhì)量，然后除去內(nèi)容物，內(nèi)壁用刷子刷凈殘余粉末，再分別精密稱定空白口罩的質(zhì)量，求出每袋的裝量與平均裝量，平均裝量與標(biāo)示量相比較，不得少于標(biāo)示量，每袋的質(zhì)量與標(biāo)示量相比較，超出質(zhì)量差異限度±7%的不得多于2 袋，并不得有1 袋超出限度的1 倍。結(jié)果平均裝量差異為4.44%，有一份口罩的裝量差異超過7%，但是不超過限度的一倍，均符合要求。

2.3.5 微生物限度 取頭痛寧口罩3 個(gè)，取出中藥粉末，稱取10 g，加pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，用勻漿儀混勻，作為1 ∶10 的供試液，要求每克的細(xì)菌數(shù)不得超過100 cfu;霉菌和酵母菌數(shù)每克的細(xì)菌數(shù)不得超過10 cfu;且不得檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌。結(jié)果每1 g 的細(xì)菌數(shù)為90 cfu;霉菌和酵母菌數(shù)每1g 的細(xì)菌數(shù)為6 cfu;未檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌，微生物限度符合要求。

2.4 樣品中成分測定

2.4.1 色譜條件 Zorbax C18色譜柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇-水(80 ∶20);檢測波長300 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫25 ℃;進(jìn)樣量10 μL。

2.4.2 溶液的配制

2.4.2.1 對照品貯備液 精密稱取在五氧化二磷干燥24 h的歐前胡素對照品22.50 mg，置100 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.2.2 供試品溶液 取頭痛寧口罩中中藥粉末2.0 g，置50 mL 量瓶中，加入80%甲醇45 mL，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)45 min，取出，放冷至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，溶液經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液即得。

2.4.2.3 陰性樣品溶液 取無白芷的中藥粉末2.0 g，置50 mL 量瓶中，加入80% 甲醇45 mL，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)45 min，取出，放冷至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，溶液經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液即得。

2.4.3 專屬性試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取缺白芷的陰性樣品溶液、供試品溶液和對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄圖譜。供試品色譜圖中在與對照品色譜峰相應(yīng)的位置上有一相同保留時(shí)間的色譜峰，而陰性樣品溶液在此保留時(shí)間處無色譜峰。表明在此色譜條件下，其他成分對歐前胡素的測定結(jié)果不存在干擾，如圖3 所示。

圖3 歐前胡素對照品(A)、陰性對照溶液(B)和供試品溶液(C)HPLC 色譜圖

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別精密吸取對照品貯備液1.0、2.0、4.0、8.0、20.0、40.0 mL 于100 mL 量瓶中，加甲醇定容后，各取10 μL 注入液相色譜儀中，測定色譜峰面積。以歐前胡素質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A =64.474C -20.012，r=0.999 9。結(jié)果表明，歐前胡素在2.25 ～90 mg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，計(jì)算精密度，結(jié)果RSD=0.07%。

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批次(20120507)樣品6 份，照上述方法測定，計(jì)算重復(fù)性，結(jié)果RSD=0.77%。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批次 (20120507)樣品，照“2.4.2”項(xiàng)方法制成供試品溶液，在0、3、6、12、24、36 h 分別進(jìn)樣，測定色譜峰面積，考察供試品的穩(wěn)定性。結(jié)果RSD = 1.32%，n = 6，說明供試品在36 h 內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量的同批次(20120507)樣品適量共9 份(相當(dāng)于歐前胡素0.34 mg)，精密稱定，分別精密加入歐前胡素對照品貯備液 (225 mg/L)1、1.5、2 mL，配制成低、中、高3 種質(zhì)量濃度系列，每一種質(zhì)量濃度配制3 份，按供試品溶液制備方法配制，照樣品含量測定方法操作，每份進(jìn)樣2 次，以平均峰面積計(jì)算歐前胡素，計(jì)算平均回收率。結(jié)果見表1。

2.4.9 樣品測定 精密稱取3 批次口罩中樣品粉末適量，按照“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液，測定各色譜峰面積，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

3 討論

當(dāng)歸辛溫性動(dòng)，其活血通絡(luò)止痛之效尤著， 《本草綱目》有“治頭痛、心腹諸痛”的記載;《丹溪心法·頭痛》云:“頭痛須用川芎，如不愈各加引經(jīng)藥，太陽川芎，陽明白芷，少陰細(xì)辛”。川芎辛溫走竄，能上行頭目，具活血搜風(fēng)止痛之效，亦可助當(dāng)歸活血通絡(luò)，祛風(fēng)止痛［10］。冰片則具有開竅醒神、清熱散毒的功效。故選擇當(dāng)歸、川芎、白芷、細(xì)辛、冰片五味藥材制備頭痛寧口罩。

表1 歐前胡素加樣回收率試驗(yàn)

表2 自制頭痛寧口罩中歐前胡素測定結(jié)果

頭痛寧口罩中有效成分歐前胡素在甲醇、乙醇中都有較好的溶解度［11］，所以本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、乙醇、水以及2 種有機(jī)溶劑與水不同比例的混合液的提取回收率，經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)80% 甲醇的提取回收率最高，故最終選擇80%甲醇作為提取溶劑。

自制頭痛寧口罩中有效成分歐前胡素在甲醇、乙醇中分別選用功率300 W，頻率50 kHz，超聲提取15、30、45 min，按照樣品前處理方法處理后，測定歐前胡素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取時(shí)間45 min 時(shí)歐前胡素的提取效率較高，因此采用超聲提取時(shí)間45 min。

文獻(xiàn)［12-13］報(bào)道選用甲醇和0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相可獲得較好的色譜峰形，本實(shí)驗(yàn)通過調(diào)整甲醇與水的比例，確定甲醇-水(80 ∶20)為流動(dòng)相，獲得了滿意的分離效果，保留時(shí)間適中。

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