RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定天智顆粒中天麻素、梔子苷、蘆丁和黃芩苷

章運(yùn)典，周里欣，陳洪英

(河南省宛西制藥股份有限公司，河南南陽 474500)

天智顆粒用于治療血管性癡呆的純中藥制劑。主要由天麻、鉤藤、槐花、梔子、黃芩、石決明、桑寄生、首烏藤等組成。具有平肝潛陽、補(bǔ)益肝腎、益智安神的功效。用于肝陽上亢中風(fēng)引起的智能減退、記憶力差、思維遲緩、定向力差、計(jì)算力差、理解多誤、伴頭暈?zāi)垦！㈩^痛、煩燥易怒、失眠、口苦咽干、腰膝酸軟等輕中度血管性癡呆的證候［1-3］?，F(xiàn)執(zhí)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只測(cè)定了天麻素的量，為有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量，本研究采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定了方中天麻素、梔子苷、蘆丁、黃芩苷4種成分的量，所建立的方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高，專屬性強(qiáng)，為本制劑提供了較全面的定量分析方法。能更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證臨床療效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀及其化學(xué)工作站，VWD檢測(cè)器，二元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，UP超純水機(jī);BP211D Satorius十萬分之一電子天平;HANGPING FA2104V電子天平;KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器。

1.2 試劑 甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 對(duì)照品 天麻素 (批號(hào)110807-200205)，梔子苷 (批號(hào)110749-201115，純度99.7%)、蘆丁(批號(hào)110080-200707，純度90.5%)、黃芩苷 (批號(hào)110857-201016，純度94.0%)，上述對(duì)照品均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用。

1.4 樣品 天智顆粒由河南省宛西制藥股份有限公司生產(chǎn) (批號(hào)分別為 20130901，20130902，20130903)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 ZORBAX SB-C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm 5 μm);流動(dòng)相為乙腈 (A)-0.05%磷酸 (B)，梯度洗脫 (0～7 min，2%A;7～15 min，2% ～15%A;15～30 min，15% ～30%A);體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。理論板數(shù)按天麻素峰計(jì)算，應(yīng)不低于2000。在此條件下，天麻素、梔子苷、蘆丁、黃芩苷峰與其他組分能達(dá)到較好分離 (見圖1)。

圖1 天智顆粒中天麻素、梔子苷、蘆丁、黃芩苷的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of gastordine，geniposide，rutin and baicalin contents in Tianzhi Granules

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取經(jīng)五氧化二磷干燥的天麻素、梔子苷、蘆丁和黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含天麻素、梔子苷、蘆丁和黃芩苷分別為0.0454、0.14407、0.15222、0.18753 mg的混合溶液，即得對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 取本品適量，研細(xì)，取約0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min(功率300 W，頻率40 kHz)，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按處方比例分別制備不含天麻、梔子、槐花、黃芩的陰性樣品，按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，制備陰性樣品溶液。

2.5 系統(tǒng)專屬性試驗(yàn) 分別吸取混合對(duì)照品溶液，供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果樣品與對(duì)照品色譜圖相同保留時(shí)間處有色譜峰，陰性樣品在與對(duì)照品色譜圖相同的保留時(shí)間處無相應(yīng)峰出現(xiàn)，表明處方中其他成分對(duì)以上4種成分的測(cè)定無干擾 (見圖1)。

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)下天麻素、梔子苷、蘆丁、黃芩苷混合對(duì)照品溶液2、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積積分值為縱坐標(biāo) (Y)，進(jìn)樣量 (X，μg)為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算，得線性方程，各對(duì)照品質(zhì)量與峰面積呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見表1。

表1 線性回歸方程Tab.1 Linear regression equation

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，按峰面積計(jì)算RSD值。天麻素、梔子苷、蘆丁、黃芩苷的峰面積RSD分別為0.9%、0.7%、0.6%、0.9%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品溶液，室溫放置，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算，天麻素、梔子苷、蘆丁、黃芩苷的RSD分別為1.3%、1.6%、1.5%和1.6%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品 (批號(hào)20130901)，按“2.3”項(xiàng)下方法分別平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算，天麻素、梔子苷、蘆丁、黃芩苷的RSD值分別為1.2%、1.1%、1.4%和1.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量 (天麻素2.3 mg/g、梔子苷7.2 mg/g、蘆丁7.5 mg/g、黃芩苷10.4 mg/g)的樣品 (批號(hào)20130901)約0.2 g，共6份，精密稱定，分別精密加入50%甲醇配制的混合對(duì)照品溶液10 mL(含天麻素、梔子苷、蘆丁和黃芩苷分別為 0.0454、0.14407、0.15222、0.18753 mg/mL)，再精密加入50%甲醇40 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)Tab.2 Results of recovery tests(n=6)

2.11 樣品測(cè)定 取3批樣品 (批號(hào)130901、130902、130903)，每批3份，按“2.3”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件對(duì)3批樣品 (進(jìn)樣量10 μL)進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，外標(biāo)法計(jì)算，數(shù)據(jù)以表示，測(cè)得結(jié)果見表3。

3 討論與小結(jié)

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇［4-10］天麻素、梔子苷、蘆丁、黃芩苷分別在220、240、257、280 nm處有最大吸收。220 nm下天麻素、梔子苷、蘆丁、黃芩苷均有較強(qiáng)的吸收，可以同時(shí)檢測(cè)4種成分，而天麻素在其他波長(zhǎng)條件下無吸收，故選擇220 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。既可以滿足檢測(cè)的需要，又簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)方案。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果 (，n=3)Tab.3 Results of content determination(，n=3)

表3 樣品測(cè)定結(jié)果 (，n=3)Tab.3 Results of content determination(，n=3)

批號(hào) 天麻素/(mg·g －1)梔子苷/(mg·g －1)蘆丁/(mg·g －1)黃芩苷/(mg·g －1)1309012.307±0.0257.200±0.0217.497±0.05110.420±0.0361309022.220±0.0367.270±0.0567.690±0.03610.197±0.0611309032.917±0.0327.510±0.0997.930±0.04611.517±0.065

3.2 提取溶劑、提取方法及提取時(shí)間的選擇［8-13］實(shí)驗(yàn)中比較了回流提取和超聲提取兩種方法制備供試品溶液，結(jié)果測(cè)得成分的量無明顯差異，由于超聲提取法具有效率高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，所以采取超聲提取法;實(shí)驗(yàn)中考察了甲醇、稀乙醇、50%甲醇、水等為提取溶劑，結(jié)果50%甲醇提取效果較好;考察了超聲提取時(shí)間20、30、40、60 min，結(jié)果超聲提取30、40、60 min，提取效率相當(dāng)，故確定以50%甲醇為提取溶劑，超聲提取30 min。

3.3 流動(dòng)相的選擇［8-13］實(shí)驗(yàn)中采用梯度洗脫，曾用乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液等作為流動(dòng)相，并調(diào)節(jié)流動(dòng)相的比例，結(jié)果以乙腈-0.05%磷酸水溶液為流動(dòng)相，分離效果好，峰形好，基線較穩(wěn)定。

3.4 小結(jié) 天智顆?，F(xiàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)［1］中，采用高效液相色譜法，只測(cè)定了天麻素的量，而且所用的流動(dòng)相也單一。中藥復(fù)方制劑均由多味藥組成，其藥效是多種活性物質(zhì)同時(shí)發(fā)揮而達(dá)到治療效果，故對(duì)于單味藥的檢測(cè)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，難以控制制劑的內(nèi)在質(zhì)量，所以為了更好地控制本產(chǎn)品的質(zhì)量，本研究采用RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定天智顆粒中天麻素、梔子苷、蘆丁和黃芩苷的量，方法簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為提升天智顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)，可用于天智顆粒的質(zhì)量控制。

［1］YBZ01682004-2008Z，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)［S］.

［2］劉憲平，康 康.天智顆粒治療輕中度血管性癡呆療效觀察［J］.中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2009，12(8):9-11.

［3］杜貴友，朱新成，趙建軍，等.天智顆粒治療老年血管性癡呆臨床觀察［J］.中國(guó)中藥雜志，2003，28(1):73-77.

［4］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:54，231，282，333.

［5］劉永利，李冬梅，馮 麗，等.RP-HPLC同時(shí)測(cè)定銀黃膠囊中綠原酸與黃芩苷含量［J］.中成藥，2006，28(8):1142-1144.

［6］黃燕萍，黃 焜.HPLC法同時(shí)測(cè)定梔子金花丸中梔子苷和黃岑苷的含量［J］.中國(guó)藥事，2010，24(10):1002-1004.

［7］李培凡，張韻慧，肖 莉，等.RP-HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地槐米中蘆?。跩］.中草藥，2006，37(9):1419-1420.

［8］程秀民，塵學(xué)蘭，高彥慧，等.RP-HPLC測(cè)定槐米中蘆丁和槲皮素含量［J］.中成藥，2004，26(8):680-682.

［9］姚 干，何宗玉.HPLC測(cè)定芩梔膠囊中黃芩苷和梔子苷的含量［J］.中成藥，2006，28(10):1442-1444.

［10］韓鳳梅，李 宇，李路軍，等.高效液相色譜法測(cè)定安宮牛黃丸中梔子苷、黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量［J］.中國(guó)中藥雜志，2007，32(14):1406-1408.

［11］高曉燕，盧建秋.梔子金花丸中梔子苷、黃芩苷、番瀉苷A和番瀉苷B的含量測(cè)定方法研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2009，34(20):2649-2651.

［12］師永清，康淑荷，王愛軍.HPLC法同時(shí)測(cè)定導(dǎo)赤丸中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷和鹽酸小檗堿［J］.中成藥，2013，35(7):1462-1465.

［13］周 蓬，宋 青，馬 帥.HPLC法同時(shí)測(cè)定小兒豉翹清熱顆粒中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素［J］.中成藥，2013，35(8):1693-1696.