覆盆子酮對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中SHP-1和IRS-1表達(dá)的影響

楊 浩，謝欣梅，龐曉斌*

(1.河南大學(xué)藥物研究所，河南開(kāi)封 475004;2.河南大學(xué)藥學(xué)院，河南開(kāi)封 475004)

糖尿病是近年來(lái)發(fā)病率逐年攀升的代謝性疾病，高血糖為其主要臨床特征，胰島素絕對(duì)或相對(duì)缺乏是其基本病理生理改變，因此，降低血糖和改善胰島素抵抗是防治糖尿病及其并發(fā)癥的基礎(chǔ)。目前臨床應(yīng)用的降糖藥主要有磺酰脲類、雙胍類、α-葡萄糖苷酶抑制劑、腸肽類激素 (GLP-1)類似物、胰島素及其類似物等。這些藥物各有局限性，尤其化學(xué)類降糖藥存在副作用大等不良反應(yīng)［1－2］。中醫(yī)藥在糖尿病治療中以其副作用小、效果顯著等特點(diǎn)顯示了極大的優(yōu)勢(shì)。

覆盆子酮是中藥覆盆子Rubus chingii Hu果實(shí)中的主要成分之一［3］，有研究表明，覆盆子果實(shí)富含鞣花酸、超氧化物、糖、黃酮、花青素、多酚類、SOD酶等［4］，現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明，覆盆子具有抗衰老、抗氧化、防止心血管疾病、降血糖、降血脂等作用，但有關(guān)覆盆子酮的降糖作用機(jī)制研究較少［5］。本研究以人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察覆盆子酮對(duì)其糖消耗的影響，探討覆盆子酮的降糖作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與主要儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物篩選中心實(shí)驗(yàn)室保存。

藥物及試劑 覆盆子酮 (Raspberry ketone)(浙江新化化工股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為09120012);DMEM培養(yǎng)基 (Gibico公司);胎牛血清 (FBS)、胰蛋白酶 (美國(guó)Hyclone公司);血糖測(cè)試盒 (氧化酶法)(北京北化康泰臨床試劑有限公司);噻唑藍(lán) (MTT)、羅格列酮、牛胰島素(美國(guó)Sigma公司);Trizol、RT-PCR試劑盒 (北京全式金生物技術(shù)有限公司);SHP-1、β-actin基因引物 (南京金維智生物技術(shù)有限公司合成);兔多克隆抗體IRS-1、β-actin，熒光標(biāo)記二抗兔抗IgG(美國(guó)Cell Signal公司);BCA法蛋白濃度測(cè)定試劑盒 (北京平原皓生物技術(shù)有限公司)。

1.2 主要儀器 超凈工作臺(tái) (SW-CJ-2FD蘇州凈化設(shè)備有限公司);二氧化碳培養(yǎng)箱 (3432Thermo Fisher Scientific);倒置顯微鏡 (ECLIPSE TS100-F NIKON);酶標(biāo)儀 (SUNRISE-BASIC TECAN Tecan Austria GmbH);凝膠成像系統(tǒng) (JYO4S-3B北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基在37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，傳代。

2.2 MTT法測(cè)定HepG2細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，調(diào)節(jié)密度為8×103cells/well，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，用于實(shí)驗(yàn)。棄上清，加入完全培養(yǎng)基配制的不同濃度覆盆子酮，使其終濃度分別為 1 ×10－6、1 ×10－5、1 ×10－4、1 ×10－3、1 ×10－2、1 ×10－1mol/L。并設(shè)空白調(diào)零孔(只加DMEM培養(yǎng)基，不加細(xì)胞)。每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在490 nm波長(zhǎng)下的吸光度 (OD)值，吸光值的高低與細(xì)胞活力成正相關(guān)性。

2.3 葡萄糖氧化酶法檢測(cè)細(xì)胞葡萄糖消耗量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以8×103cells/well接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，貼壁12 h后，細(xì)胞融合度70%，用于葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)分為空白組、對(duì)照組、覆盆子酮組、羅格列酮陽(yáng)性對(duì)照組 (3×10－5mol/L)。空白組:無(wú)細(xì)胞，只加入等量培養(yǎng)基;對(duì)照組:有細(xì)胞，不加藥，只加入等量培養(yǎng)基;覆盆子酮的終濃度分別為1 ×10－8、1 ×10－7、1×10－6、1 ×10－5、1×10－4、1×10－3mol/L。每組設(shè) 3個(gè)復(fù)孔。加藥24 h以葡萄糖氧化酶法檢測(cè)培養(yǎng)液上清液中的葡萄糖量。

葡萄糖消耗量 (mmol/L)=預(yù)定時(shí)間點(diǎn)空白組孔殘余在培養(yǎng)基中的平均葡萄糖量－預(yù)定時(shí)間點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)組殘余在培養(yǎng)基中的葡萄糖量。

2.4 RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞SHP-1 mRNA基因的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以8×104cells/well接種在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后分別加入不同濃度的覆盆子酮，使其終濃度分別為10－6、10－5、10－4mol/L，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)48 h。用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。利用 RTPCR試劑盒擴(kuò)增 SHP-1基因。SHP-1-正向引物:5'-CCTGGAGACTTCGTGCTTT-3'，SHP-1-反向引物:5'-GGCGATGTAGGTCTTAGCG-3'。產(chǎn)物長(zhǎng)度為546 bp。β-actin為內(nèi)參，正向引物:5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，反向引物:5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為186 bp。

擴(kuò)增條件 β-actin基因:94℃ 5 min，94℃30 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，72℃ 10 min，共38個(gè)循環(huán)。SHP-1基因:94℃ 5 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 10 min，共38個(gè)循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳并通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)SHP-1與β-actin基因表達(dá)量。

2.5 Western Blot檢測(cè)IRS-1蛋白的表達(dá) 收集相應(yīng)處理后的各組細(xì)胞，用預(yù)冷細(xì)胞裂解液裂解，提取細(xì)胞總蛋白。配置10%分離膠和濃縮膠，取30 μg蛋白加入上樣緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入IRS-1(1∶1000)一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗5次，二抗 (1∶2000)孵育2 h，TBST洗5次，通過(guò) ECL試劑盒進(jìn)行顯影檢測(cè)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 覆盆子酮對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各劑量的覆盆子酮對(duì)HepG2細(xì)胞的活力無(wú)明顯影響 (P＞0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 覆盆子酮對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響 (n=3，)Fig.1 Effect of raspberry ketone on cell viability of HepG2 cells(n=3，)

3.2 覆盆子酮對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1×10－8～1×10－3mol/L濃度的覆盆子酮作用細(xì)胞24 h后，均可促進(jìn)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量，其中1×10－6～1×10－3mol/L劑量組差異顯著 (P＜0.05)。與對(duì)照組相比，1×10－6～1×10－3mol/L劑量組葡萄糖消耗量增加率可達(dá)22.41% ～44.63%，1×10－4mol/L劑量組葡萄糖消耗最大 (44.63%)，接近于羅格列酮組(47.96%)。見(jiàn)圖2。

圖2 覆盆子酮對(duì)HepG2葡萄糖消耗的影響 (n=3，)Fig.2 Effect of raspberry ketone on glucose consumption in HepG2 cells(n=3，)

3.3 覆盆子酮對(duì)HepG2細(xì)胞SHP-1 mRNA基因表達(dá)的影響 由圖3可知:PCR擴(kuò)增條帶位置正確:β-actin(186 bp)，SHP-1(546 bp)。與對(duì)照組相比，經(jīng)覆盆子酮作用后，隨覆盆子酮濃度的增加，HepG2細(xì)胞SHP-1 mRNA基因表達(dá)呈劑量依賴性的明顯降低 (P＜0.01)。見(jiàn)圖3。

3.4 覆盆子酮對(duì)HepG2細(xì)胞IRS-1蛋白表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)覆盆子酮作用后，HepG2細(xì)胞 IRS-1蛋白表達(dá)量明顯提高(P＜0.01)。并且不同濃度的覆盆子酮呈劑量依賴性的增加IRS-1蛋白表達(dá)量。見(jiàn)圖4。

圖3 覆盆子酮對(duì)HepG2細(xì)胞SHP-1 mRNA表達(dá)的影響 (n=3，)Fig.3 Effect of raspberry ketone on mRNA expression of SHP-1 in HepG2 cells(n=3，)

圖4 覆盆子酮對(duì)HepG2細(xì)胞IRS-1蛋白表達(dá)的影響(n=3，)Fig.4 Effect of raspberry ketone on expression of IRS-1 in HepG2 cells(n=3，)

4 討論

糖尿病是目前僅次于腫瘤和心腦血管病的嚴(yán)重威脅人類健康的常見(jiàn)病，以高血糖為其主要臨床特征，臨床常用降糖藥物，治療效果各有局限性，尋找治療糖尿病的新藥已成為防治糖尿病的研究熱點(diǎn)。覆盆子酮是中藥覆盆子果實(shí)中的主要成分之一。有研究表明，覆盆子具有降血糖、降血脂等作用［5-6］，本研究以人肝癌HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，探討覆盆子酮的體外降糖作用及其相關(guān)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，降糖寧對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響，說(shuō)明覆盆子酮對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞無(wú)明顯毒性。

葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)是體外實(shí)驗(yàn)中評(píng)價(jià)藥物是否具有降糖作用的常用方法之一，常用的細(xì)胞系有HepG2人肝癌細(xì)胞、3T3-L1小鼠脂肪細(xì)胞、L6大鼠骨骼肌細(xì)胞［7-8］。本實(shí)驗(yàn)選用HepG2人肝癌細(xì)胞進(jìn)行葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)了覆盆子酮對(duì)細(xì)胞葡萄糖消耗的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示覆盆子酮具有良好的降糖作用，可明顯促進(jìn)HepG2葡萄糖消耗，1×10－4mol/L劑量組葡萄糖消耗最大 (44.63%)，降糖效果接近于羅格列酮組 (47.96%)。

胰島素受體底物 (IRS-1)與胰島素受體(IR)結(jié)合后被磷酸化，參與胰島素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上游蛋白［9-11］。磷酸化的IRS-1通過(guò)激活PI3K/AKT通路，進(jìn)而增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子-4(glucose transporter 4，GLUT4)的膜轉(zhuǎn)位及轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖能力，促進(jìn)組織、細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用［12-14］。本研究結(jié)果表明1×10－6～1×10－4mol/L濃度范圍內(nèi)的覆盆子酮均能增加HepG2細(xì)胞IRS-1蛋白表達(dá)量，并且呈劑量依賴性關(guān)系，提示覆盆子酮可以促進(jìn)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中胰島素受體底物的表達(dá)，進(jìn)而起到降糖作用。

SHP1是體內(nèi)廣泛表達(dá)的胞內(nèi)蛋白酪氨酸磷酸酶 (PTP)，SHP1和磷酸化的IR和IRS-1結(jié)合在一起參與胰島素信號(hào)通路的調(diào)節(jié)［15-16］。SHP1通過(guò)與胰島素受體結(jié)合并使之去磷酸化，減弱胰島素的活化，進(jìn)而抑制IRS-PI3K-Akt通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［17］。SHP1缺失，導(dǎo)致胰島素引發(fā)的IR、IRS-1和IRS-2的酪氨酸磷酸化水平升高，以及PI3K和Akt的活化［18-19］。因而，通過(guò)抑制SHP1在體內(nèi)的活性，有可能恢復(fù)糖尿病病人對(duì)血糖的控制能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1×10－6～1×10－4mol/L的覆盆子酮呈劑量依賴性地下調(diào)SHP-1 mRNA基因表達(dá)量。此結(jié)果提示覆盆子酮可能通過(guò)抑制HepG2細(xì)胞中SHP-1的表達(dá)量，增強(qiáng)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的磷酸化水平，從而發(fā)揮其降糖作用。

綜上所述，覆盆子酮可明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗。覆盆子酮的降糖作用機(jī)制可能與影響胰島素信號(hào)通路中IRS-1和SHP-1的表達(dá)有關(guān)。覆盆子酮對(duì)胰島素信號(hào)通路中其他靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)作用還需進(jìn)一步深入研究。

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