RP-HPLC 法同時(shí)測(cè)定寶咳寧顆粒中4 種成分

周 卿， 楊建文， 鄭天宇

(1. 遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州遵義563003;2. 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，貴州遵義563003)

寶咳寧顆粒是由黃芩、前胡、枳殼、青黛、麻黃、桑葉等十六味中藥組成，主要用于治療小兒外感風(fēng)寒、內(nèi)熱停食引起的頭痛身燒、咳嗽痰盛、咽喉腫痛、煩躁不安等，屬國(guó)家中藥保護(hù)品種。在現(xiàn)行《中國(guó)藥典》2010 年版中僅收載了高效液相色譜法測(cè)定黃芩苷［1-2］。為滿足對(duì)復(fù)雜的中藥復(fù)方體系的質(zhì)量控制要求，選擇多指標(biāo)的測(cè)定可以有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量［3］，故選取了處方中枳殼、黃芩、青黛、前胡四味藥中的代表性成分柚皮苷［4-8］、黃芩苷［9］、靛玉紅［10-12］和白花前胡甲素［13-15］作為檢測(cè)指標(biāo)，建立了高效液相色譜法同時(shí)定量測(cè)定的方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 全自動(dòng)高效液相色譜儀(DAD 檢測(cè)器)(美國(guó)安捷倫公司);KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);BT125D十萬(wàn)分之一電子天平(賽多利斯北京有限公司)。

柚皮苷(批號(hào)110722-201111)、黃芩苷(批號(hào) 110715-201117 )、靛 玉 紅 (批 號(hào) 110717-200204)、白花前胡甲素 (批號(hào)111711-200602)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;寶咳寧顆粒(規(guī)格:2.5g/袋)購(gòu)自本地藥材市場(chǎng);乙腈、甲醇(色譜純，百靈威化學(xué)有限公司);重蒸餾水;其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 漢邦Dubhe-C18色譜柱 (4.5 mm× 250 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈 (A)-0.05%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0 min，22%A;7 min，30%A;12 min，60%A;18 ～20 min，95%A);體積流量為1.0 mL/min;柱溫25 ℃;進(jìn)樣量20 μL;柚皮苷、黃芩苷和靛玉紅檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，白花前胡甲素為321 nm。在該色譜條件下，取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示柚皮苷、黃芩苷、靛玉紅和白花前胡甲素保留時(shí)間分別為6.2、9.2、17.5、19.1 min，樣品中其他組分不干擾測(cè)定，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以白花前胡甲素計(jì)大于6 000，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 寶咳寧顆粒的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of Baokening Granules

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 分別精密稱取柚皮苷、黃芩苷對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL、1.0 mg/mL 的對(duì)照品溶液;精密稱定白花前胡甲素，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的對(duì)照品溶液，并用甲醇稀釋制備0.01 mg/mL 的對(duì)照品溶液;精密稱取靛玉紅對(duì)照品適量，加丙酮制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的對(duì)照品溶液，置于4 ℃冰箱中保存，待用。

2.2.2 供試品溶液 取寶咳寧顆粒適量，研細(xì)，精密稱取該藥細(xì)粉1.0 g，加入60%甲醇定容至50 mL，稱定質(zhì)量，水浴超聲 (功率500 W，40 kHz)提取45 min 后，放置室溫，加60%甲醇補(bǔ)足失去質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取濾液20 μL 進(jìn)樣分析。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方比例分別制備缺枳殼、黃芩、青黛、前胡藥材的陰性樣品，依“2.2.2”項(xiàng)下制備陰性樣品溶液。

2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)中所配各對(duì)照品溶液適量于10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋并定容，配置系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，分別取20 μL 在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，以對(duì)照品質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸。得柚皮苷回歸方程為Y ﹦21.29X +69.63，r ﹦0.999 2;黃芩苷為Y﹦68.88 X+ 203.5，r ﹦0.999 1;靛玉紅為Y ﹦27.26 X -0.79，r ﹦0.999 0;百花前胡甲素為Y ﹦1.07 X-3.52，r ﹦0.999 1。

結(jié)果表明，柚皮苷在5 ～120 μg/mL，黃芩苷在2 ～60 μg/mL，靛玉紅在0.5 ～5.0 μg/mL，白花前胡甲素在10 ～100 ng/mL 范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。最低檢測(cè)限以性噪比為3 計(jì)算，柚皮苷為50 ng，黃芩苷為50 ng，靛玉紅為10 ng，白花前胡甲素為10 ng。

2.4 精密度試驗(yàn) 精密配制含柚皮苷100 μg/mL、黃芩苷40 μg/mL，靛玉紅2 μg/mL，白花前胡甲素40 ng/mL 的對(duì)照品混合溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次，以峰面積計(jì)算柚皮苷、黃芩苷、靛玉紅和白花前胡甲素的RSD 值分別為0.7%、0.3%、0.6%、1.0%。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取廠家1 樣品制備5 份供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定，結(jié)果柚皮苷、黃芩苷、靛玉紅和白花前胡甲素的RSD 分別為0.8%、1.2%、1.1%、1.8%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取廠家1 樣品制備供試品溶液，置于室溫，分別于0、1、2、4、6、8、12、24 h在上述色譜條件下測(cè)定，結(jié)果柚皮苷、黃芩苷、靛玉紅和白花前胡甲素的RSD 分別為0.5%、0.3%、0.9%、1.6%，表明樣品中4 種成分在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取廠家2 (批號(hào)20140204)寶咳靈顆粒9 份，每份0.50 g，按高、中、低3 種加入量分別精密加入“2.2.1”項(xiàng)下柚皮苷、黃芩苷、靛玉紅和白花前胡甲素對(duì)照品溶液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法樣制備樣品溶液，分別測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.8 樣品測(cè)定 分別取3 個(gè)不同廠家寶咳寧顆粒各3 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，按外標(biāo)法計(jì)算藥物中4 種成分的量，結(jié)果見(jiàn)表2。- 表示未檢出

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

表2 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.2 Determination of samples (n=3)

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)選用了不同比例的甲醇、乙醇進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示采用60%甲醇提取率較高，且樣品峰形良好，樣品成分提取較完全，故選擇60%甲醇作為提取溶劑。實(shí)驗(yàn)中還比較了加熱回流、索氏提取及超聲提取4 種不同的提取方法，結(jié)果顯示當(dāng)超聲提取45 min 時(shí)，所測(cè)4 種成分的量明顯優(yōu)于索氏提取4 h，加熱回流最低，故采用超聲提取方法。

3.2 本實(shí)驗(yàn)因同時(shí)測(cè)定的4 種成分具有不同的極性，采用固定比例的流動(dòng)相難以一次分離完全，采用梯度洗脫，可在20 min 內(nèi)同時(shí)檢出該4 種成分。流動(dòng)相的選擇比較了甲醇-水、甲醇-0.05%H3PO4和乙腈-0.05% H3PO4等多種流動(dòng)相的分離效果，結(jié)果顯示采用甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)，各成分峰型較差，拖尾嚴(yán)重，而加入H3PO4后，峰型得到較大改善，且在梯度洗脫中，因采用甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，基線漂移較大，后改用乙腈得到改善。

3.3 不同廠家寶咳寧顆粒中4 種成分測(cè)定結(jié)果顯示，只有按照《中國(guó)藥典》規(guī)定檢測(cè)的黃芩苷含有量較接近，其余3 種成分的量有一定差異，因此在復(fù)方中成藥的質(zhì)量控制中，建立多指標(biāo)的質(zhì)量控制方法有一定的必要性。

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