RP-HPLC 法測定黃芪及玉屏風(fēng)顆粒中4 種異黃酮類成分

周 倩， 李 瑩 ， 戴衍朋， 沈秀娟， 孫立立

(山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014)

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge. var. mongholicus (Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus (Fisch)Bge.的干燥根［1］。黃芪性溫，味甘，歸肺、脾經(jīng)，具有補(bǔ)氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌的功效，為臨床經(jīng)典補(bǔ)益中藥。玉屏風(fēng)顆粒是以黃芪為主藥的經(jīng)典方劑，具有益氣、固表、止汗等功效，在改善免疫力方面具有較顯著的效果［2-3］。黃芪主要成分包括皂苷、黃酮、多糖、氨基酸等［4-8］，其中黃酮類成分文獻(xiàn)報(bào)道具有顯著的預(yù)防和治療心血管疾病，抗氧化，抗衰老以及增強(qiáng)機(jī)體免疫等功能［9］，為黃芪主要活性成分之一。《中國藥典》2010 年版僅對黃芪黃酮中毛蕊異黃酮苷的量進(jìn)行了規(guī)定［1］，對玉屏風(fēng)顆粒中黃酮類成分未作要求。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前研究中對玉屏風(fēng)制劑中黃芪黃酮類成分進(jìn)行定量測定的報(bào)道也較少［10-11］。本實(shí)驗(yàn)通過研究建立了黃芪飲片及其復(fù)方玉屏風(fēng)顆粒中毛蕊異黃酮、芒柄花素、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷4 種黃酮類成分的定量測定方法。一方面可為黃芪飲片及其制劑的質(zhì)量控制提供更全面的質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)，同時(shí)通過對黃芪飲片與玉屏風(fēng)顆粒中各成分的量比較，考察復(fù)方配伍對黃芪中黃酮類成分提取率的影響。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Waters600 高效液相色譜儀，996 二極管陣列檢測器，十萬分之一電子天平 (Sartorius R200D，德國);HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市晶玻試驗(yàn)儀器廠);RE-2000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試藥與試劑 乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。毛蕊異黃酮苷 (批號120312)、芒柄花苷(批號120415)、毛蕊異黃酮(批號120519)、芒柄花素(批號120530)均購自上海麗臣商貿(mào)有限公司，純度均＞98%。

1.3 供試樣品 黃芪飲片，產(chǎn)地甘肅。經(jīng)本院中藥資源開發(fā)研究室林慧彬研究員鑒定為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge. Var.mongholicus (Bge.)Hsiao 或膜莢黃芪Astragalusmembranaceu s (Fisch.)Bge 的干燥根。市售玉屏風(fēng)顆粒，生產(chǎn)廠家為廣東環(huán)球制藥有限公司，批號分別為121216 和130313。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 玉屏風(fēng)顆粒制備 照《中國藥典》2010 年版收載玉屏風(fēng)顆?！局品ā宽?xiàng)下方法制備:取防風(fēng)200 g，酌予碎斷，提取揮發(fā)油，蒸餾后水液另器收集;藥渣及其余二味 (黃芪600 g，炒白術(shù)200 g)加水煎煮二次，第一次1.5 h，第二次1 h，合并煎液，濾過，濾液濃縮至適量，加乙醇至含醇量為70%，攪拌，靜置，濾過，濾液濃縮至為清膏，加輔料制成顆粒，干燥，放冷，噴加上防風(fēng)揮發(fā)油，混勻，制成約500 g，即得。

2.2 色譜條件［12］Phenomenex Luna C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);以乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)為流動相梯度洗脫(0→8 min，20%A→30%A;8→16 min，30%A→45%A;16→20 min，45% A →60% A;20 →23 min，60% A →100% A;23 →30 min，100% A);體 積 流 量1.0 mL/min;檢測波長251 nm，柱溫25 ℃。

2.3 對照品溶液的制備 分別精密稱取各對照品適量，置同一量瓶中，加甲醇制成含毛蕊異黃酮苷0.066 mg/mL、芒柄花苷0.033 mg/mL、毛蕊異黃酮0.035 mg/mL、芒柄花素0.017 mg/mL 的混合溶液。

2.4 樣品溶液制備 取黃芪粉末(過40 目篩)約1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 mL，加熱回流提取40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足失減質(zhì)量，搖勻，濾過，濾液減壓回收至干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?0 mL量瓶中，混勻，過0.45 μm 微孔濾膜，即得黃芪供試品溶液。

取玉屏風(fēng)顆粒約1 g，精密稱定，同法制成玉屏風(fēng)顆粒供試品溶液。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 在上述色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL 注入液相色譜儀，測定。結(jié)果對照品峰與其他峰均可達(dá)到基線分離，且保留時(shí)間適中。供試品保留時(shí)間和峰形均與對照品一致，說明該分析條件良好。見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察 取對照品溶液，進(jìn)樣量依次為2、4、8、10、12 μL，測定峰面積，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，毛蕊異黃酮苷為Y =13 429.66X +47.60，r =0.999 6，線性范圍0.132 ～0.792 μg;芒柄花苷為Y = 20 871.58 X - 133.61，r =0.999 3，線性范圍0.066 ～0.396 μg;毛蕊異黃酮為Y=25 316.25X-12.56，r =0.999 8，線性范圍0.07 ～0.42 μg;芒柄花素為Y = 32 969.97X -37.21，r=0.999 9，線性范圍0.034 ～0.204 μg。

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5 次，測定峰面積值，結(jié)果毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素峰面積的RSD 分別為0.9%、1.1%、1.0%、0.8% (n =5)。表明儀器精密度良好。

圖1 HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取黃芪供試品溶液和玉屏風(fēng)顆粒各10 μL，分別于0、2、4、8、12 h 進(jìn)行測定。結(jié)果黃芪中毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素峰面積的RSD 分別為2.1%、2.6%、1.6%和1.5%。玉屏風(fēng)顆粒中4 個(gè)成分峰面積的 RSD 依次為 2.0%、2.1%、2.1% 和1.8%。表明兩樣品均在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批黃芪樣品和玉屏風(fēng)顆粒6 份，分別制備供試品溶液，依法測定，結(jié)果黃芪中毛蕊異黃酮苷RSD 為1.8%，芒柄花苷RSD為2.3%，毛蕊異黃酮RSD 為2.0%，芒柄花素RSD 為1.8%。玉屏風(fēng)顆粒中4 個(gè)成分的RSD 分別為2.2%、2.0%、2.3%和2.3%。表明本法重復(fù)性良好。

2.10 回收率試驗(yàn) 取已知含有量的黃芪樣品和玉屏風(fēng)顆粒6 份，各0.5 g，精密稱定，分別精密加入各對照品適量，依法提取測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1 和表2。

表1 黃芪飲片加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.1 Results of recovery tests for Astragali Radix (n=6)

表2 玉屏風(fēng)顆?；厥章试囼?yàn)結(jié)果(n=6)Tab.2 Results of recovery tests for Yupingfeng Granules(n=6)

2.11 樣品測定 精密吸取上述樣品及對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，照上述色譜條件依法測定，計(jì)算，結(jié)果見表3，市售玉屏風(fēng)顆粒測定結(jié)果見表4。

表3 黃芪及自制復(fù)方中黃酮類成分測定結(jié)果Tab.3 Determination results of Astragali Radix and homemade compounds

表4 市售玉屏風(fēng)顆粒中黃酮類成分測定結(jié)果Tab.4 Determination results of Yupingfeng Granules commercially available

3 小結(jié)與討論

本研究前期對色譜條件進(jìn)行了考察，通過對乙腈-水和乙腈-0.1%磷酸等流動相系統(tǒng)的比較，不同柱溫下分離效果的考察，以及不同檢測波長比較，確定以乙腈-0.1%磷酸作為流動相梯度洗脫，檢測波長251 nm，柱溫25 ℃。在優(yōu)選的色譜條件下，各色譜峰的保留時(shí)間適中，分離度較好，且基線穩(wěn)定。

本研究建立的黃芪飲片及其復(fù)方玉屏風(fēng)顆粒中4 個(gè)黃酮類成分的定量測定方法，經(jīng)方法學(xué)考察，表明該方法操作簡便，重復(fù)性好，測定結(jié)果準(zhǔn)確，可用于黃芪及其復(fù)方的測定。

采用本方法對玉屏風(fēng)顆粒以及制備玉屏風(fēng)顆粒用的同批次黃芪飲片進(jìn)行了成分比較，結(jié)果可見，毛蕊異黃酮和芒柄花素的量在飲片及自制復(fù)方中測得的含有量差異不大，而復(fù)方中毛蕊異黃酮苷和芒柄花苷量約為黃芪飲片該成分含有量的2 倍左右，分析其原因一方面為在玉屏風(fēng)顆粒制備過程中，以水作為提取溶劑進(jìn)行提取，可使極性相對較大的毛蕊異黃酮苷和芒柄花苷煎出率提高，另一方面黃芪與白術(shù)和防風(fēng)混合煎煮提取，可能提高了黃芪中毛蕊異黃酮苷和芒柄花苷兩個(gè)成分的溶出率。

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