野生藍莓提取物對四種致病菌的抑制作用

姜文潔 ，孫曉紅* ，朱 穎，楊 晗，趙 勇，吳啟華，潘迎捷

1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306;2美國緬因大學(xué)食品與農(nóng)業(yè)學(xué)院，緬因 04469

藍莓，又名越橘，屬于杜鵑花科常綠灌木，果實為深藍色，外面裹有一層白色的果粉，單果重量在0.5～2.5 g 之間，果肉細膩，酸甜適宜，風(fēng)味獨特，營養(yǎng)價值高，被譽為“水果皇后”，是第三代水果的典型代表。隨著人們生活水平的日益提高和保健意識的不斷增強，藍莓作為一種時尚保健水果，逐漸受到廣大消費者的青睞。我國的大興安林、小興安嶺以及長白山地區(qū)分布著大量的野生藍莓，而自上世紀80年代開始，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)李亞東教授率先引種藍莓后，栽培藍莓的面積也不斷擴大，主要分布在我國的長白山、大小興安嶺地區(qū)，遼東半島、膠東半島地區(qū)，長江流域地區(qū)以及華南地區(qū)。野生藍莓與人工栽培藍莓相比，其果實偏小，水分和糖含量較少。野生藍莓除含有糖、有機酸和維生素C 外，還含有許多其它的營養(yǎng)成分，如有機鍺、有機硒、熊果甙、氨基酸、果酸等，是其它植物無可比擬的。此外，野生藍莓中花青苷色素(花青素、矮青牛配基和甲基花青素等)含量高達3.3～33.8 mg/kg，約是人工栽培品種的5～20 倍［1］。其中花青素是一種生物類黃酮，是目前國際上公認的清除人體內(nèi)自由基最有效的天然抗氧化劑。美國農(nóng)業(yè)部(USDA)的研究顯示，在人們經(jīng)常食用的40 種蔬菜和水果中，野生藍莓的抗氧化能力最高［2］。Kristo［3］等人曾經(jīng)給患有自發(fā)性高血壓的小鼠喂食添加野生藍莓的食物，與對照組相比，添加野生藍莓組的小鼠體內(nèi)硫酸化粘多糖的含量顯著減少，同時野生藍莓的添加改變了小鼠體內(nèi)大動脈粘多糖的分布。然而，由于野生藍莓口感較差及人們對其營養(yǎng)價值的認識匱乏而一直得不到重視，國內(nèi)針對野生藍莓的研究也鮮有報道。

近年來，食品安全問題已經(jīng)成為人們關(guān)注的熱點話題。由致病菌引起的疾病也逐漸成為食品安全的重要隱患。日常生活中常見的致病菌有很多，如沙門氏菌、志賀氏菌、單增李斯特菌、創(chuàng)傷弧菌等食源性致病菌。根據(jù)國家衛(wèi)計委關(guān)于2013年第一季度全國食物中毒事件情況的通報，第一季度，微生物性食物中毒事件的中毒人數(shù)最多，主要由沙門氏菌、副溶血性弧菌、大腸埃希氏菌、葡萄球菌腸毒素等引起。因此，采取有效措施控制致病菌的污染顯得十分重要。目前，抗生素以及化學(xué)保鮮劑是避免致病菌污染的常用方法，抗生素的方法使得這些細菌產(chǎn)生耐藥性，化學(xué)保鮮劑的安全問題也愈益為人們所擔(dān)心。Caillet［4］等人研究結(jié)果表明，藍莓提取物對沙門氏菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌等致病菌均有一定的抑制作用。本研究首次選用中國野生藍莓為原料，研究其提取物對四種致病菌的抑制作用，為深入研究藍莓的活性成分，最終開發(fā)新型天然無污染的防腐劑奠定了基礎(chǔ)，同時也為中國野生藍莓資源的進一步開發(fā)利用提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

野生藍莓購于哈爾濱高泰食品有限公司，保存于-20 ℃冰箱。銅綠假單胞菌(ATCC27853)、單增李斯特菌 (ATCC19115)、副溶血性弧菌(ATCC33847)購于美國ATCC 菌種保藏中心。金黃色葡萄球菌(AB91093)購自上海疾病預(yù)防與控制中心。無水乙醇購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)，胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 提取物的制備

參考謝慶超等［5］方法。取適量野生藍莓凍果，微波加熱1～2 min，進行快速解凍，然后放入勻漿機中充分攪碎。稱取20 g 勻漿至錐形瓶里，加入65%乙醇200 mL，超聲波處理25 min，用布氏漏斗過濾，濾液用0.22 μm 的濾膜過濾，取濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，待乙醇揮發(fā)完全后，將上清液濃縮至2 g/mL，總體積為10 mL，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 四種菌菌液的制備

取于-80 ℃、25%甘油保存的四種菌種，其中銅綠假單胞菌、單增李斯特菌與金黃色葡萄球菌，分別接種于TSB 液體培養(yǎng)基，副溶血性弧菌接種于3%NaCl 的TSB 液體培養(yǎng)基中;在37 ℃下活化后，劃線接種于TSA 瓊脂(或3%NaCl 的TSA 瓊脂)，挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，在37 ℃下培養(yǎng)至對數(shù)期(OD600=0.8)?；罨瘍纱魏?，調(diào)整菌懸液的濃度，使其保持106CFU/mL。

1.2.3 最小抑菌濃度(MIC)的測定

參照呂平［6］等人的方法，采用試管二倍稀釋法，取11 支無菌試管，向第2 至第11 支試管中加入2 mL TSB;在第1 支試管中加入野生藍莓提取物原液(2 g/mL)2 mL，在第2 支試管中加入2 mL 的野生藍莓提取物混勻，混勻后再吸取2 mL 至第3 支試管，如此倍比稀釋至到第9 支試管，混勻后吸取2 mL 棄去。第10 支試管為不加藍莓提取液的生長對照。第11 支試管里加入2 mL 無菌TSB 和2 mL 野生藍莓提取液，混勻后棄去2 mL。這樣第1 支試管至第9 支試管的藍莓粗提液濃度分別為2000、

1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 mg/mL。向編號為1～10 的10 支試管中加入10 μL四種菌的菌液，37 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察并記錄結(jié)果。以肉眼觀察，通過與生長對照相比，不發(fā)生渾濁變化的最高藥物稀釋倍數(shù)為該藥物的MIC 值。實驗重復(fù)進行3 次。

1.2.4 最小殺菌濃度(MBC)的測定

在試管二倍稀釋法測定MIC 的基礎(chǔ)上，參照呂平［6］等人的方法，選擇所有澄清的試管，將其培養(yǎng)液進行稀釋，涂平板，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以菌落數(shù)不超過5 個的最低藍莓提取物的濃度為MBC 值。實驗重復(fù)進行3 次。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果均以平均數(shù)±標準偏差表示，采用SPSS17.0 軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行分析(P=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生藍莓對四種致病菌的抑制效果

由表1 可以看出，野生藍莓對四種致病菌的抑制作用不同，四種食源性致病菌對野生藍莓提取物的敏感程度也不同。副溶血性弧菌對野生藍莓提取物最敏感，當野生藍莓提取物濃度為62.5 mg/mL時，副溶血性弧菌的量減少了3.54 logCFU/mL，當提取物濃度達到125 mg/mL 時，副溶血性弧菌可以完全被殺死。金黃色葡萄球菌對野生藍莓提取物最不敏感，當野生藍莓提取物濃度為250 mg/mL 時，金黃色葡萄球菌的量僅減少了2.98 logCFU/mL，當提取物濃度高達500 mg/mL 時，金黃色葡萄球菌可以被完全殺死。

表1 野生藍莓提取物對四種致病菌的抑制效果Table 1 The antibacterial effects of wild blueberry extracts against the 4 investigated bacteria

注:a 表示經(jīng)24 h 培養(yǎng)后，生長對照組菌落總數(shù)與實驗組菌落總數(shù)有顯著性差異(P＜0.05)。Note:a represents a significance difference from control after 24 h’s cultivation (P＜0.05).

2.2 野生藍莓對四種食源性致病菌MIC 值的測定

利用試管二倍稀釋法，通過觀察每支試管渾濁度的變化以及輔助涂布平板的方法，分別測定了野生藍莓提取物對四種致病菌的MIC 值。

表2 野生藍莓對四種致病菌的MIC 測定結(jié)果Table 2 The MIC of wild blueberry extracts against the 4 investigated bacteria

由表2 可以看出，野生藍莓對四種致病菌銅綠假單胞菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌以及副溶血性弧菌都有抑制作用，而且對不同菌的抑制程度不同。野生藍莓提取物對副溶血性弧菌的抑制作用最強，MIC 為31.25 mg/mL，對銅綠假單胞菌的MIC為62.5 mg/mL，對單增李斯特菌的MIC 為250 mg/mL，而野生藍莓提取物對金黃色葡萄球菌的抑制效果較差，MIC 高達500 mg/mL。

2.3 野生藍莓對四種食源性致病菌MBC 值的測定

在MIC 的基礎(chǔ)上，選取所有澄清的試管，進行涂布平板，培養(yǎng)24 h，以菌落數(shù)不超過5 個的最低藥物濃度為該藥物的MBC 值。

表3 野生藍莓對四種致病菌的MBC 值Table 3 The MBC of wild blueberry extracts against 4 investigated bacteria

由表3 可以看出，野生藍莓對單增李斯特菌和銅綠假單胞菌的MBC 值均為250 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MBC 值為500 mg/mL，而對副溶血性弧菌的抑制效果最好，僅為125 mg/mL。

3 討論

本研究結(jié)果表明，野生藍莓提取物對四種致病菌均有不同程度的抑制作用。對銅綠假單胞菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌與副溶血性弧菌的MIC 值分別為62.5、250、500 mg/mL 與31.25 mg/mL。沈瀟［7］等人的研究表明，栽培藍莓杜克和藍豐對金黃色葡萄球菌的MIC 分別為900 mg/mL 和600 mg/mL，遠大于野生藍莓對金黃色葡萄球菌的MIC值500 mg/mL。由此可得，野生藍莓能更好的抑制金黃色葡萄球菌的生長。Wu［8］等通過研究美國越橘中酚醛、花青素和有機酸等成分對大腸桿菌O157:H7 的抑制作用，得出這3 種成分均有不同程度的抑菌效果，且酚類物質(zhì)的抑菌效果最好。而Buratti［9］等人曾研究過野生藍莓和栽培藍莓中的酚類物質(zhì)含量的差異，結(jié)果表明:野生藍莓中的總酚含量是栽培藍莓中總酚含量的兩倍。本課題組研究表明野生藍莓對金黃色葡萄球菌抑制效果比栽培藍莓好，可能是因為野生藍莓比栽培藍莓含有更多的酚類物質(zhì)，因此表現(xiàn)出比栽培藍莓更強的抑菌活性。

通過抑菌實驗測定，發(fā)現(xiàn)野生藍莓提取物對副溶血性弧菌的MIC 值和MBC 值最小，抑菌效果最好，而對金黃色葡萄球菌的MIC 值和MBC 值最大，說明抑制效果最差。Wu［10］等人研究表明，美國藍莓提取物中的抑菌活性物質(zhì)通過破壞細菌細胞的細胞壁，細胞膜從而導(dǎo)致細菌溶解而死亡。根據(jù)本研究所得結(jié)果，副溶血性弧菌(革蘭氏陰性)對野生藍莓提取物遠比金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性)敏感。這可能是由于革蘭氏陽性細菌的細胞壁較革蘭氏陰性細菌的細胞壁厚，抑菌成分不容易破壞其細胞壁，所以對革蘭氏陽性細菌的抑制效果不如革蘭氏陰性細菌好。

藍莓具有降低血壓、保護視力、延緩衰老和增強記憶力等功能。本研究表明野生藍莓對致病菌還具一定的抑制作用。因此，正常人每天食用一定的藍莓鮮果，不僅可以起到保健功能，而且還可以大大降低每天由食物中攝入的致病菌的含量。近年來，國內(nèi)對于人工栽培藍莓的研究已經(jīng)成為一大熱點，包括它的活性成分和營養(yǎng)價值，然而關(guān)于野生藍莓的研究報道卻比較少。由于野生藍莓產(chǎn)業(yè)化程度低、掠奪式采摘現(xiàn)象較為嚴重，造成野生資源的嚴重浪費，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，野生藍莓對致病菌有較強的抑制作用，而天然植物防腐劑又是當今研究的一大熱點，所以開發(fā)利用野生藍莓作為天然、無毒無害的防腐劑具有廣闊的市場前景，可以創(chuàng)造經(jīng)濟效益。

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