葛內(nèi)生真菌抑菌活性菌株的篩選及鑒定

萬(wàn)陜寧，麻玉萍，王家穩(wěn)，魏希穎

陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教育部藥用植物資源與天然藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710119

研究報(bào)道，植物內(nèi)生菌具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化等多種生物活性，對(duì)于植物內(nèi)生真菌抗菌活性的研究是內(nèi)生真菌研究的主要內(nèi)容［1，2］，也是人們目前尋找新型藥物的重要來(lái)源［3］。

葛(Pueraria lobata)，是我國(guó)衛(wèi)生部首批批準(zhǔn)的藥食兩用植物，其根、莖、葉、花均可入藥，臨床上常用單味藥或復(fù)方制劑治療冠心病、心肌梗塞和高血壓病，現(xiàn)已廣泛用于食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域［4］。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)分離自葛的112 株內(nèi)生真菌的抗菌作用進(jìn)行研究，以期為抗菌藥物的獲得找到新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

內(nèi)生真菌:陜西師范大學(xué)應(yīng)用微生物實(shí)驗(yàn)室保存的112 株葛內(nèi)生真菌。

供試指示細(xì)菌:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus 26003)、大腸桿菌(Escherichia coli A70)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereuss A18)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium A20)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans A89)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis A99)、白色葡萄球菌(Staphylococcus white A113)、藤黃八疊球菌(Sarcinaluteu A119)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidernidis 2429)、肺炎鏈球菌(streptococcus pnuemoniae 1692)。

指示植物病原真菌:番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)、蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌(Valsa mali Var)、葡萄炭疽病菌(Colletortrichum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、玉米大斑病菌(Helminthosporiummaydis)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici)、小麥根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)。供試菌株均由陜西省微生物研究所提供，陜西師范大學(xué)應(yīng)用微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

青霉素鈉(哈藥集團(tuán)制藥廠生產(chǎn)，批號(hào):A061115207);鏈霉素(Amresco，批號(hào):LOTZO10/07);氟康唑(山東康寧藥業(yè)有限公司，批號(hào);H44023370);兩性霉素(AmB)(武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)制藥有限公司，批號(hào):H20070816);Taq 聚合酶、擴(kuò)增緩沖液、DNA Marker DL2000，購(gòu)自上海生工生物公司。

1.1.3 培養(yǎng)基［5］

細(xì)菌培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基;真菌培養(yǎng)基:PDA 培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

細(xì)菌的活化:將指示菌接種到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，備用。

真菌的活化:將指示真菌接種到PDA 斜面培養(yǎng)基上，28 ℃的恒溫培養(yǎng)48～72 h，備用。

1.2.2 葛內(nèi)生真菌抗細(xì)菌活性觀察［6］

吸取200 μL 指示菌菌懸液，涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基表面，制成含菌平板，其上放置3 個(gè)無(wú)菌牛津杯，用移液槍加入200 μL 葛內(nèi)生真菌的發(fā)酵液，等量的青霉素鈉(80 IU/mL)和鏈霉素(50 mg/mL)作為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌水做陰性對(duì)照，以上均在37 ℃培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，抑菌圈的邊緣以肉眼見(jiàn)不到菌明顯生長(zhǎng)為限。選取抑菌作用較好的菌株繼續(xù)進(jìn)行下一步研究。

1.2.3 葛內(nèi)生真菌抗植物病原真菌活性的觀察

將抗細(xì)菌效果較好的內(nèi)生真菌，運(yùn)用皿內(nèi)對(duì)峙法［7］進(jìn)行抗真菌活性觀察，即將內(nèi)生真菌和指示真菌分別用5 mm 的打孔器制成菌餅，內(nèi)生真菌菌餅放在固體培養(yǎng)基的中央，在其周圍等徑放置4 個(gè)指示菌的菌餅，28 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，用PDA 培養(yǎng)基上正常培養(yǎng)的植物病原菌作為對(duì)照，選出有抑菌帶的菌株。

將上述實(shí)驗(yàn)中具有明顯抑菌帶的菌株，參照郭建新報(bào)道的紙片擴(kuò)散法［8］進(jìn)行復(fù)篩，方法如下:將植物病原菌菌懸液稀釋至濃度為108CPU/mL，吸取200 μL 涂布到PDA 平板上，制成含菌板。將直徑為5 mm 的無(wú)菌濾紙片放在含菌板上，其上加20 μL真菌發(fā)酵液，做3 個(gè)重復(fù)，28 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，記錄菌株發(fā)酵液抑菌圈的直徑，結(jié)果取平均值。兩性霉素AmB(1 mg/mL)和氟康唑(1 mg/mL)作為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，挑選出抑菌圈直徑最大的菌株。

1.2.4 廣譜抗菌菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

采用真菌插片培養(yǎng)方法對(duì)高抗菌活性內(nèi)生真菌的菌落、菌絲和孢子等特征進(jìn)行顯微鏡觀察，參照《真菌鑒定手冊(cè)》［9］和《現(xiàn)代醫(yī)學(xué)真菌鑒定手冊(cè)》［10］進(jìn)行鑒定。

1.2.5 廣譜抗菌菌株分子生物學(xué)鑒定:

用真菌通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')經(jīng)PCR 從真菌基因組DNA 中擴(kuò)增出rRNA基因的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITSs)。反應(yīng)條件:95 ℃5 min;95 ℃1 min，51 ℃1 min，72 ℃1 min，35 個(gè)循環(huán);72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物的純化:PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用DNA 凝膠純化試劑盒回收瓊脂糖凝膠中的PCR 產(chǎn)物。純化后的PCR產(chǎn)物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與討論

2.1 葛內(nèi)生真菌抗細(xì)菌活性測(cè)試結(jié)果

葛內(nèi)生真菌抗細(xì)菌活性測(cè)試結(jié)果如表1 及表2所示。從表1 中可以看出，在所有內(nèi)生真菌中，抗菌活性菌株有74 株，占分離到內(nèi)生真菌的66%。其中根中得到22 株，莖中有47 株，葉中有5 株。其中高活性菌株(抑菌圈Φ≥15 mm)有39 株，占抗菌活性菌株的42%。

從表2 中可看出，在39 株高活性菌株中，J1-3、J5-2、J24-1、J25-2、J31-3、J100-2、GG9 這7 株菌對(duì)8種以上指示菌均有抑制作用，且抑菌效果較好。

表1 葛內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物的抑菌活性及其分布Table 1 The antimicrobial activities and distribution of endophytic fungi metabolites in Pueraria lobata

注:低活性:抑菌圈Φ＜10 mm，中等活性:抑菌圈10 mm≤Φ＜15 mm，高活性:抑菌圈Φ≥15 mm Note:Low activity:Φ＜10 mm;Middle activity:10 mm≤Φ＜15 mm;High activity:Φ≥15 mm.

表2 39 株高活性葛內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物抑細(xì)菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Antimicrobial experiment of high active 39 strains

注:①G 表示根部;J 表示莖部;Y 表示葉部。②-:Φ＜10 mm;+:10 mm＜Φ＜15 mm;++:15 mm＜Φ＜20 mm;+++:Φ＞25 mm。③DS:陰性對(duì)照無(wú)菌水;DL:陽(yáng)性對(duì)照鏈毒素(50 mg/L);DQ:對(duì)照青霉素(80 IU/mL)。Note:①G—Root，J—Stem，Y—Leaf.②-:Φ＜10 mm;+:10 mm＜Φ＜15 mm;++:15 mm＜Φ＜25 mm;+++:Φ＞25 mm.③DS:sterile water (negative control);DL:streptomycin (50 mg/L)(positive control);DQ:penicillin(80 IU/mL)(positive control).

2.2 葛植物內(nèi)生真菌抗植物病原菌活性測(cè)試結(jié)果

對(duì)7 株具有較好抗細(xì)菌活性的菌株，進(jìn)行抗植物病原菌活性測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3 中可發(fā)現(xiàn)，J5-2、J31-3、J100-2 對(duì)幾種不同的病原真菌有較廣泛的抑制作用。其中J100-2 對(duì)5 株病原真菌(蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌、番茄灰霉菌、油菜菌核病菌、玉米大斑病菌、辣椒炭疽病菌)均有抑制作用，是一株廣譜的抗菌活菌性菌株。

表3 葛內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物抗真菌實(shí)驗(yàn)Table 3 Antimicrobial experiment of Pueraria lobata

2.3 廣譜抗菌菌株J100-2 的形態(tài)學(xué)鑒定

經(jīng)培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)J100-2 菌株在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 天后，菌落呈直徑為3～4 cm 的圓形，表面干燥，中央凸起呈褐黑色，四周較松散成黑色厚絨狀，邊緣為白色，菌絲呈放射狀向四周生長(zhǎng)，菌落背面為黃色。經(jīng)顯微觀察發(fā)現(xiàn)其菌絲較細(xì)，有隔，分生孢子囊呈球形。結(jié)果見(jiàn)圖1 和2。根據(jù)菌株J100-2 的菌落形態(tài)和顯微特征，初步將其鑒定為莖點(diǎn)霉屬真菌Phoma macrostoma.

圖1 J100-2 的菌落形態(tài)特征Fig.1 colonial characteristics of J100-2

圖2 J100-2 的菌絲體和孢子(10 ×40)Fig.2 Spore and hgphae morphlology of J100-2 (10 ×40)

2.4 廣譜抗菌菌株J100-2 的ITS 序列分析

利用ITS 通用引物ITS1 和ITS4 經(jīng)PCR 從內(nèi)生真菌J100-2 基因組DNA 中擴(kuò)增出長(zhǎng)約700bp 的單一DNA 條帶，對(duì)純化的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行DNA 測(cè)序分析。結(jié)果表明，J100-2 的ITS 序列長(zhǎng)750bp，將其序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，對(duì)菌株的18SrRNA 序列采用Clustalx 軟件進(jìn)行序列比對(duì)，然后利用MEGA 4.0 軟件的最大可能性法(Maximum Likelihood methods)，構(gòu)建了分離得到的產(chǎn)活性菌株及同源性較高的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。并且繪制出18SrRNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)。

結(jié)果表明:該序列與莖點(diǎn)霉屬的真菌Phoma macrostoma.的ITS 序列(序列號(hào)為HM755951.1)同源性為99%，由圖3 看出菌株J100-2 與HM755951.1 處于一個(gè)最小的分枝內(nèi)，進(jìn)化上距離最近。結(jié)合前面進(jìn)行的形態(tài)學(xué)特征的鑒定，從而進(jìn)一步驗(yàn)證菌株J100-2 與Phoma macrostoma.是同一個(gè)種，根據(jù)最新版的《真菌詞典》將其無(wú)性階段歸于巨腔莖點(diǎn)霉。其分類地位如下:半知菌(Deuteromycotia)腔胞綱(Coelomycetes)球殼孢目(Sphaeropsidales)莖點(diǎn)霉屬(phoma)巨腔莖點(diǎn)霉(P.macrostoma)

圖3 J100-2 內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of endophytic fungus J100-2

2.5 討論

植物內(nèi)生菌作為抗生素來(lái)源的一個(gè)新的研究領(lǐng)域，發(fā)展?jié)摿薮?。其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)往往是新穎的，研究顯示，51%的從植物內(nèi)生真菌分離的生物活性物質(zhì)是以前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的化合物［11］;且大多數(shù)對(duì)動(dòng)、植物細(xì)胞無(wú)毒;內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物:生物堿、環(huán)肽類、萜類、甾體類、醌類化合物、脂類、酚類及有機(jī)酸等都具有一定抗菌活性［12］，它們的天然產(chǎn)物都可以殺滅或抑制很多病原微生物。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)葛的不同組織分離到的內(nèi)生真菌進(jìn)行抗菌活性菌株的大規(guī)模的篩選，得到39 株活性較高的菌株，說(shuō)明葛內(nèi)生真菌中抑菌活性菌株的普遍性;有7 株菌對(duì)細(xì)菌具有良好的抑制作用，其中5 株菌對(duì)植物病原菌具有不同程度的抑制作用，尤其是J100-2 對(duì)多種病原菌具有抑制作用，結(jié)果表明葛內(nèi)生真菌在果樹(shù)病害防治領(lǐng)域具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的價(jià)值，以后可開(kāi)展活性代謝產(chǎn)物的提取及抑菌活性物質(zhì)成分分析的進(jìn)一步研究。

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