川梔子中京尼平苷的提取吸附工藝研究

劉育容，丁克毅，劉 軍

西南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境保護(hù)工程學(xué)院，成都 610041

梔子(Gardenia jasminoides Ellis)是茜草科梔子屬植物，常綠灌木或小喬木。據(jù)《本草衍義補(bǔ)遺》、《本草綱目》等記載，梔子性苦寒、無(wú)毒，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒及治療扭挫傷的作用［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，梔子具有清熱鎮(zhèn)痛、保肝利膽等功效，臨床上用于治療急性黃疸型肝炎、止痛、扭挫傷、冠心病等［2］。梔子的化學(xué)成分很復(fù)雜，但國(guó)內(nèi)外所公認(rèn)的中藥梔子有效成分為環(huán)烯醚萜類化合物，其中以京尼平苷的含量最高。分析表明，隨著產(chǎn)地的不同，梔子中京尼平苷的含量約為3%～8% 左右［3］。

本文選用資源豐富的川產(chǎn)梔子作為原料，集中產(chǎn)于川東、川南各山區(qū)縣的梔子，長(zhǎng)期以來(lái)只作為一種中藥材原料出售，經(jīng)濟(jì)效益較差［4，5］。因此，有必要開(kāi)展低成本、高純度京尼平苷的提取工藝研究，使川梔子的資源優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)化為產(chǎn)業(yè)和經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)。

大孔吸附樹(shù)脂是近年來(lái)新發(fā)展起來(lái)的一種有機(jī)高分子聚合物吸附劑，其應(yīng)用日趨廣泛，特別是在天然產(chǎn)物的分離純化方面逐漸顯示出其優(yōu)越性［6］。目前關(guān)于大孔樹(shù)脂分離梔子中京尼平苷的報(bào)道較少，廖夫生等［7］報(bào)道了大孔樹(shù)脂對(duì)梔子中京尼平苷的提取分離工藝研究，但未見(jiàn)優(yōu)化提取溶劑用量的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在采用環(huán)境友好的溶劑作為溶媒，提取川梔子中京尼平苷，并通過(guò)研究不同型號(hào)大孔樹(shù)脂對(duì)京尼平苷吸附能力和解吸率，確定包括提取溶劑用量等參數(shù)，進(jìn)一步優(yōu)化吸附提取京尼平苷的工藝路線。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

試劑:京尼平苷對(duì)照品，由中國(guó)生物制品鑒定所提供;梔子、色譜純乙腈及其他常規(guī)試劑(均為分析純)由成都化學(xué)試劑廠提供;HP-20、HPD-100、HPD-450、D-101、D-101A 大孔樹(shù)脂均由滄州寶恩化工有限公司提供。

儀器:Agilent 1200 series 型色譜儀(美國(guó)安捷倫公司);ZF-I 型三用紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠);SF-200C 型高速粉碎機(jī)(上海中藥機(jī)械廠)。

1.2 薄層層析法鑒別京尼平苷

取一定藥材，采用高速粉碎機(jī)打粉，過(guò)20 目篩后取1 g，加50%甲醇10 mL，超聲處理40 min，過(guò)濾，取濾液作為藥材溶液。另取京尼平苷對(duì)照品，加甲醇制成對(duì)照品溶液。

按照《中國(guó)藥典》薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液，分別點(diǎn)于同一硅膠薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干。采用三用紫外分析儀，波長(zhǎng)為254 nm 的條件下，觀察薄層板斑點(diǎn)。通過(guò)TLC 法對(duì)藥材進(jìn)行定性分析，供試品與對(duì)照品在薄層板同一水平位置上有相同的斑點(diǎn)，經(jīng)顯色劑顯色后具有相同的顯色，可知該藥材中含有京尼平苷。

1.3 HPLC 測(cè)定京尼平苷的含量

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Gemini C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱，流動(dòng)相為乙腈∶水=15∶85，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)是238 nm，流動(dòng)相為0.8 mL·min-1，進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.2 溶液的配置

對(duì)照品溶液的制備:精密稱取京尼平苷對(duì)照品適量，加甲醇制成0.0300 mg·mL-1的溶液。供試品溶液的制備:取梔子粉末約0.1 g，置于錐形瓶中，加入甲醇25 mL，超聲處理20 min 后過(guò)濾。精密量取上層濾液10 mL，置25 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻即得。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取對(duì)照品溶液，配成系列不同濃度的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。以溶液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到回歸線方程。

1.3.4 方法驗(yàn)證

精密度試驗(yàn):精密吸取京尼平苷對(duì)照品溶液，按照1.3.1 色譜方法重復(fù)進(jìn)樣6 次。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取上述供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h 進(jìn)樣分析。

重復(fù)性試驗(yàn):精密稱取6 份2 g 的梔子粉末，分別加50 mL 純水提取三次，每次1 h，按1.3.2 中供試品溶液的制備方法，得到供試品溶液;再按1.3.1色譜條件測(cè)定。

加樣回收率實(shí)驗(yàn):精密移取6 份已知含量的京尼平苷提取液5 mL 置于25 mL 容量瓶?jī)?nèi)，分別加入5 mL 已知含量50%，100%，150% 濃度為1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，定容，備用。取6 份(6.00 g/份)預(yù)處理后的D-101 大孔吸附樹(shù)脂，以水為溶劑濕法裝柱，依次加入制備好的備用樣品溶液，控制吸附過(guò)程體積流量為2 柱體積/h，分別以體積分?jǐn)?shù)為20%乙醇溶液洗脫上述樹(shù)脂柱，收集洗脫液，減壓旋干，用10mL 甲醇定容，濾過(guò)，計(jì)算回收率。

1.4 提取工藝優(yōu)化

1.4.1 正交實(shí)驗(yàn)方案

中藥材提取中，通常影響比較大的因素有:提取時(shí)間、提取溶媒、料液比。本實(shí)驗(yàn)考察了這3 個(gè)水平因素對(duì)京尼平苷提取率的影響，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)方案。見(jiàn)表1。

表1 正交設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.4.2 正交實(shí)驗(yàn)

干燥的川產(chǎn)梔子切片經(jīng)過(guò)高速粉碎機(jī)粉碎打粉，過(guò)20 目篩，準(zhǔn)確稱取9 份10.00 g 的梔子粉末，根據(jù)表2 中所示的9 組特定實(shí)驗(yàn)條件浸提梔子中的京尼平苷后抽濾，合并兩次提取濾液，然后用水定容至200 mL，冷藏，備用。

1.4.3 溶液的配置

對(duì)照品的制備:精密稱定京尼平苷對(duì)照品適量，加甲醇制成0.0600 mg·mL-1的溶液，備用。

供試品溶液的制備:從9 組正交實(shí)驗(yàn)所配制的溶液中分別精密量取0.5 mL，置于10 mL 容量瓶中定容，搖勻，備用。按照1.3.1 色譜方法測(cè)定樣品中京尼平苷的含量。

1.5 大孔樹(shù)脂對(duì)京尼平苷的吸附研究

1.5.1 大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理及含水率的測(cè)定

分別取D-101、HP-20、HPD-100、HPD-450、D-101A 大孔吸附樹(shù)脂各40 g/份，以堿醇法預(yù)處理，淋凈水后待用，并測(cè)定其含水率。

1.5.2 提取及上柱樣品預(yù)處理

稱取梔子藥材200 g，加入6 倍體積(料液比)的水，回流提取2 次，每次沸騰1 h。合并提取液后離心，取上清液，調(diào)至樣品液體積為藥材4 倍(料液比)，過(guò)濾。精密吸取樣品溶液4 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，甲醇溶解定容至50 mL，HPLC 測(cè)定其中京尼平苷含量。

1.5.3 京尼平苷靜態(tài)吸附容量考察

精密稱取預(yù)處理后的D-101、HP-20、HPD-100、HPD-450、D-101A 大孔吸附樹(shù)脂各6.00 g/份，置于100 mL 錐形瓶?jī)?nèi)，分別加入上述各樣品溶液50 mL，于室溫靜置1、2、4、8、12 h 后，過(guò)濾，取上層濾液5mL 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干。甲醇溶解定容于50 mL容量瓶中，測(cè)定含量，計(jì)算靜態(tài)吸附量、吸附率。最大比吸附量(mg/g)=(吸附前藥液濃度-吸附后藥液濃度)×吸附液體積/樹(shù)脂干重，繪制京尼平苷靜態(tài)吸附曲線。

1.5.4 大孔吸附樹(shù)脂對(duì)京尼平苷吸附、解吸量

1.5.4.1 京尼平苷動(dòng)態(tài)解吸曲線的測(cè)定

取預(yù)處理后的D-101、HP-20、HPD-100、HPD-450、D-101A 大孔吸附樹(shù)脂各6.00 g/份，濕法裝柱，然后加入濃度為1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，控制吸附過(guò)程體積流量為2 柱體積/h，分別以體積分?jǐn)?shù)為20%乙醇溶液洗脫上述樹(shù)脂柱，收集洗脫液10 mL/份，洗脫至供試品與對(duì)照品的洗脫液在TLC 板上顯相同的斑點(diǎn)。精密吸取各洗脫液5mL，旋干，甲醇溶解定容至50 mL，測(cè)定京尼平苷含量及洗脫率，繪制動(dòng)態(tài)洗脫曲線。

1.5.4.2 洗脫物中京尼平苷含量測(cè)定

精密稱取預(yù)處理后的D-101、HP-20、HPD-100、HPD-450、D-101A 大孔吸附樹(shù)脂各6.00 g/份，以上述方法上樣、洗脫，合并收集洗脫液，測(cè)定含量。分別精密量取各洗脫液2 mL/份，各2 份，置于恒重量瓶中，揮干乙醇，于105 ℃烘干至恒重，測(cè)定其固型物量，計(jì)算京尼平苷百分含量。

1.6 大孔樹(shù)脂的再生

樹(shù)脂在使用一次后，一般用95%的乙醇洗脫至無(wú)色，即已再生。然后再用大量純化水沖洗，即可進(jìn)行下一次的分離。經(jīng)反復(fù)使用后，大孔吸附樹(shù)脂顏色變深，吸附效果下降，可用醇?jí)A溶液洗滌或浸泡適當(dāng)時(shí)間，直至樹(shù)脂接近原顏色，繼續(xù)用水洗至中性即可再用。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的考察

在本實(shí)驗(yàn)條件下，分別注入京尼平苷對(duì)照品溶液20 μL，以溶液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，求得回歸方程Y=0.0006X-0.0795，r=0.9995，說(shuō)明京尼平苷在0.0087mg·mL-1～0.1044 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。且在該色譜條件下無(wú)雜峰干擾，特征吸收峰明顯，分離效果良好(見(jiàn)圖1)。

圖1 京尼平苷的HPLC 譜圖Fig.1 The HPLC of geniposide

2.2 方法驗(yàn)證

精密度試驗(yàn)中測(cè)得京尼平苷含量的RSD 值為2.50%，表明儀器精密度良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)中測(cè)得京尼平苷含量的RSD 值為2.98%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)得京尼平苷含量的RSD 值為2.50%，表明方法重復(fù)性良好。加樣回收率試驗(yàn)計(jì)算得平均回收率為98.52%，RSD 為2.36%。

2.3 京尼平苷的提取工藝

從正交實(shí)驗(yàn)(表2)中，可以看出乙醇濃度越高越有利于梔子黃色素的提取，乙醇濃度越低越有利于梔子環(huán)烯醚萜類化合物的提?。?］。由R 值的大小知，3 個(gè)因素對(duì)京尼平苷浸提效果影響的主次順序?yàn)?B 溶媒＞A 料液比＞C 浸提溫度;由京尼平苷的含量結(jié)果，可得京尼平苷的最佳浸提條件為A1B1C1，即料液比為1∶6，提取溶媒為水，浸提時(shí)間為1h。

注:A 為料液比(v/v)，B 為提取溶媒，C 為提取時(shí)間(h)，D 為京尼平苷含量，K1、K2、K3為該因素分別在1、2、3 三個(gè)水平因素下3個(gè)試驗(yàn)結(jié)果之和，R 為該因素下三個(gè)水平的極差值。

2.4 大孔樹(shù)脂對(duì)京尼平苷的吸附

2.4.1 大孔樹(shù)脂的含水率

預(yù)處理后的大孔吸附樹(shù)脂含水率考察，其結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 預(yù)處理后大孔吸附樹(shù)脂含水率考察Table 3 The moisture content of macroporous adsorption resin after pretreatment

2.4.2 京尼平苷靜態(tài)吸附容量考察

由京尼平苷靜態(tài)吸附曲線，得到5 種樹(shù)脂對(duì)京尼平苷的最大吸附量大小順序?yàn)?HPD-100＞HPD-450＞D-101＞D-101A＞HP-20。

圖2 京尼平苷靜態(tài)吸附曲線Fig.2 The static adsorption curve of geniposide

2.4.3 大孔吸附樹(shù)脂對(duì)京尼平苷吸附、解吸量

2.4.3.1 京尼平苷動(dòng)態(tài)解吸曲線的測(cè)定

測(cè)定京尼平苷含量及洗脫率，繪制動(dòng)態(tài)洗脫曲線，如圖3 為京尼平苷在HP-20 中動(dòng)態(tài)解吸曲線。測(cè)得5 種樹(shù)脂對(duì)京尼平苷的洗脫率大小順序?yàn)?HP-20＞ HPD-100＞D-101A＞ HPD-450＞ D-101。

2.4.3.2 洗脫物中京尼平苷含量測(cè)定

D-101、HP-20、HPD-100、HPD-450、D-101A 5 種樹(shù)脂洗脫物中京尼平苷的含量大小順序?yàn)?HP -20＞HPD-100＞D-101＞D-101A＞HPD-450。

圖3 京尼平苷動(dòng)態(tài)吸附曲線Fig.3 The dynamic adsorption curve of geniposide

表4 不同樹(shù)脂洗脫物中京尼平苷含量Table 4 Geniposide contents in different resin elution

3 結(jié)論

(1)運(yùn)用正交試驗(yàn)對(duì)京尼平苷的浸提工藝進(jìn)行了研究，結(jié)果表明:提取溶媒、料液比、提取時(shí)間3 個(gè)因素對(duì)京尼平苷和浸提效果的影響主次順序?yàn)?B提取溶媒＞A 料液比＞C 提取時(shí)間;梔子的最佳浸提條件是加6 倍的水，浸提兩次，每次煮沸1 h。

(2)綜合HP-20、HPD-100、HPD-450、D-101、D-101A 五種不同型號(hào)的大孔吸附樹(shù)脂的吸附、解吸及純化物含量性能，確定HPD-100、HP-20 有較強(qiáng)的吸附能力、極好的解吸率，其純化產(chǎn)物京尼平苷含量高，可作為提取京尼平苷的良好純化材料，但考慮到HP-20 價(jià)格較貴，最終選定HPD-100 作為從川產(chǎn)梔子中提取京尼平苷的最佳吸附樹(shù)脂;而且HPD-100樹(shù)脂再生后重復(fù)使用的效果也很好，這也進(jìn)一步降低了制備京尼平苷的工藝成本。

1 Shu YL (舒迎斕).Ancient Gardenia jasminoides and Its Cultivation and Utilization.Agricultural History of China.Nanjing:China Agriculture Press (中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社)，1992，3.78-84.

2 Xie XJ (謝學(xué)建)，Zhang JH (張俊慧)，Ma AH (馬愛(ài)華).Evolved investigation of Chinese traditional medicinegardenoside.LiShiZhen Medicine and Materia Medica Research (時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥)，2000，11:94-95.

3 Zheng LS (鄭禮勝)，Liu XQ (劉向前).Advances in the research of iridoids.Nat Prod Res Dev (天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā))，2009，11:702-711.

4 Fu HL (付紅蕾)，Liang HZ (梁華正)，Liao FS (廖夫生).Present condition and perspective of utilization of the geniposide in Gardenia jasminoides.LiShiZhen Medicine and Materia Medica Research (時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥)，2005，16:54-56.

5 Li WQ (李文琪)，Zhao XM (趙新民).The technologystudy for refining of geniposide.Anhui Med Pharm J(安徽醫(yī)藥)，2005，9:647-648.

6 Wang ZG(王爭(zhēng)剛)，Lu XW(路緒旺)，Cui P(崔鵬).Adsorption and purification of toosendanin by Macropo rous Rein.Nat Prod Res Dev (天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā))，2008，6:1080-1083.

7 Liao FS(廖夫生)，F(xiàn)u HL(付紅蕾)，Le CG(樂(lè)長(zhǎng)高)，Wei P(韋鵬).Extraction and isolation of geniposide from gardenia fruit.LiShiZhen Medicine and Materia Medica Research(時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥)，2005，16:89-91.

8 Yan SH (閻少輝)，Zhang DQ (張德權(quán)).The research progress and development of pigments from Gardenia jasminoides.Food Res Dev(食品研究與開(kāi)發(fā))，2000，21:28-31.