丁岙楊梅揮發(fā)油成分及抗腫瘤活性的研究

劉 濤，金吉林，金吉芬，彭志軍，羅福賢

貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹科學(xué)研究所，貴陽 550006

楊梅(Myricarubra Sieb.et Zucc)為楊梅科楊梅屬亞熱帶常綠果樹，原產(chǎn)我國東南部，以浙江、江蘇、福建等省為主要產(chǎn)區(qū)［1-4］。楊梅果鮮汁旺、風(fēng)味獨特、營養(yǎng)豐富［5，6］。作為我國的傳統(tǒng)特產(chǎn)水果，楊梅色澤鮮艷、汁液多，營養(yǎng)價值高，風(fēng)味獨特，能生津解渴，助消化，浸酒。中醫(yī)認為，楊梅性溫味甘酸，具有生津止渴、和胃調(diào)食、行氣止痛的功效［5］?！侗静菥V目》中記載:“楊梅味酸甜，性溫、無毒。能止渴、和五臟、滌腸胃，除煩潰惡氣”［7］?！堕_寶本草》中記載:楊梅“主去痰、止嘔、斷下痢，清食解酒”［3］。果實中主要含有葡萄糖、果糖、維生素﹑蛋白質(zhì)、檸檬酸等［8］，楊梅中的微量營養(yǎng)元素主要包括花青素和多酚類，這兩類物質(zhì)對于楊梅的營養(yǎng)、感官、生物活性、商業(yè)價值均具有重要的意義，其中多酚類化合物主要有:對羥基苯甲酸類(食子酸、原兒茶酸等)、黃酮類(槲皮素、楊梅黃酮等)、鞣質(zhì)(水解鞣質(zhì)、縮合鞣質(zhì))等［9］。在溫州市茶山鎮(zhèn)大羅山上，滿山是清一色的楊梅樹，稱茶山“丁岙梅”。王賢親等采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)對丁岙楊梅葉的揮發(fā)油化學(xué)成分進行了分析［10］，而目前對于丁岙楊梅果實揮發(fā)油化學(xué)成分的研究尚未見報道。本文以水蒸氣蒸餾法提取其揮發(fā)性成分，采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)對其化學(xué)成分進行分析鑒定，同時研究了丁岙楊梅揮發(fā)油的抗腫瘤生物活性，為其質(zhì)量全面評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 材料與試劑

丁岙楊梅果實由貴州省荔波縣甲良楊梅基地提供，于2013年6 月采摘同株樹上成熟度一致的果實，剔除爛果。RPMI 1640 培養(yǎng)基(美國GIBICO 公司);胰蛋白酶(美國SIGMA 公司);胎牛血清(天津市灝陽生物制品科技有限公司);MTT(北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展有限公司);SDS(北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

ISQ 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo 公司);YXQ-LS-50 滅菌鍋(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);XW-80A 旋渦混合器(上海精科實業(yè)有限公司);CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO 公司)。

1.3 供試細胞

胃癌細胞株MGC-803、乳腺癌細胞株MCF-7 以及肺癌細胞株A549 購自中科院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所細胞庫。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油提取

將新鮮的丁岙楊梅去皮及其籽，陰涼處風(fēng)干后，粉碎。將粉末35 g 放入1 L 燒瓶中，加水200 mL 和數(shù)粒玻璃珠，連接揮發(fā)油測定器和回流冷凝管，在電熱套中進行提取，等沸騰后保持微沸4 h，直至揮發(fā)油不再增加為止。提取結(jié)束后，將揮發(fā)油提取器下端的水相除去，收集黃色油層，再用無水硫酸鈉干燥備用。

2.2 氣相色譜條件

氣象色譜HP-5 MS 5% phenyl Methyl Siloxane(0.25 μm×0.25 mm×30 m)彈性石英毛細管柱，柱溫以50 ℃起并以5 ℃/min 升溫到280 ℃，保持10 min;汽化室溫度為250 ℃，載氣為高純 He(99.999%)，載氣流量為1.5 mL/min，進樣量為1 μL(用將樣品稀釋的溶液)，不分流。

2.3 質(zhì)譜條件

離子源為EI 源，離子源溫度為280 ℃，電子能量是70 eV，接口溫度為280 ℃，溶劑延遲2 min，質(zhì)量范圍m/z 40～550。所得質(zhì)譜圖通過HPMSD 化學(xué)工作站，結(jié)合Nist 5 標準質(zhì)譜圖庫，根據(jù)有關(guān)文獻進行人工檢索解析鑒定樣品中化學(xué)成分的質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表1。

2.4 抗腫瘤活性測試

將96 孔板的上、下行用滅菌二次水封邊，每孔200 μL。取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后，重懸于含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，以2 ×104cells/mL 的終濃度接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，最右側(cè)一列為空白對照組，加無細胞的有血清RPMI 1640 培養(yǎng)基。置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 使細胞貼壁。吸掉培養(yǎng)基，加入含不同藥物濃度的有血清培養(yǎng)基，每孔200 μL，注意培養(yǎng)基中DMSO 終濃度不能超過0.1%，空白對照組每孔加200 μL 完全培養(yǎng)基。分別處理實驗要求時間，去除上清，加100 μL/well 濃度0.5 mg/mL 的MTT。培養(yǎng)4 h 后再補加100 μL/well 的10% 的SDS。37 ℃下10 h 使結(jié)晶物充分溶解后取出，微震蕩5 min，放置室溫下30 min，在A595波長下測OD值，并計算細胞活性、抑制率和P 值［11-13］。以藥物濃度或處理時間為橫軸，OD 值或者抑制率為縱軸，繪制曲線。每樣本濃度重復(fù)六個孔，每個實驗重復(fù)三次，取平均值為最終結(jié)果。實驗結(jié)果以SPSS 軟件進行方差分析，P＜0.05 時為差異顯著，P＜0.01 時為差異極顯著，實驗結(jié)果如圖1 所示。細胞增殖的抑制率計算公式如下:

表1 丁岙楊梅果實揮發(fā)油的成分及相對含量Table 1 Analytical results for GC-MS identification of volatile compounds in M.rubra

圖1 丁岙楊梅果實揮發(fā)油對腫瘤細胞抑制率Fig.1 The inhibitory effects of volatile oil on different tumor cell lines in vitro

3 討論

本文使用水蒸氣蒸餾法從丁岙楊梅果實中提取揮發(fā)油，通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法對其進行化學(xué)成分分析。如圖1 所示，從丁岙楊梅果實揮發(fā)油中分離得到33 個峰，鑒定出了其中的27 個化合物，已鑒定的化合物占總組分的92.37%，其主要成分為:石竹烯(20.80%)、鄰苯二甲酸己烷-3-醇異丁醇酯(9.73%)、棕櫚酸(26.55%)、2，2'-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)(6.55%)、鄰苯二甲酸二異辛酯(4.23%)、β-谷甾醇(3.23%)等。本文與文獻［10］分析得出的丁岙楊梅葉揮發(fā)油化學(xué)成分有較大差異，丁岙楊梅葉的主要化學(xué)成分為石竹烯(49.79%)、α-石竹烯(24.16%)、橙花叔醇(16.59%)、石竹烯氧化物(2.21%)等?？梢?，丁岙楊梅果實及其葉揮發(fā)油的主要化學(xué)成分除石竹烯外其它化學(xué)成分的鑒定結(jié)果不盡相同，且化學(xué)成分的含量差異也較大。

此外，本文使用MTT 法測定了丁岙楊梅果實揮發(fā)油對腫瘤細胞MGC-803、MCF-7 和A549 體外增殖的抑制作用。如圖2 測定結(jié)果表明，丁岙楊梅果實揮發(fā)油表現(xiàn)了較好的抗腫瘤活性，在質(zhì)量濃度為200 μg/mL 時對腫瘤細胞MGC-803、MCF-7 和A549體外增殖的抑制率分別為57.3%、42.0% 和42.4%。如圖1 所示，其抑制作用并呈現(xiàn)濃度依賴性，隨著濃度的變大，對三種細胞的體外增殖的抑制活性呈現(xiàn)增加的趨勢。

丁岙楊梅果實揮發(fā)油化學(xué)成分較為復(fù)雜，含有大量的有機酸、酯、萜、酚、甾體、烷烴等，含有少量的醛類化合物，從而構(gòu)成其特有的藥用價值，對這些化學(xué)成分的提取分離和純化以及利用還有待于深入研究，以實現(xiàn)對丁岙楊梅的深層次開發(fā)利用。

1 Xiao ZB(肖卓炳)，Chen S(陳上)，Ma MY(麻明友)，et al.Characterization of polyphenol oxidase in Myricarubra fruits.Food Sci(食品科學(xué))，2009，30:306-308.

2 Ma HF(馬惠芬)，Yan ZL(閆爭亮)，Ze SZ(澤桑梓)，et al.GC/MS analysis of volatile components from leaf of Myricaesculenta Buch.-Ham.Guangdong Agric Sci(廣東農(nóng)業(yè)科學(xué))，2011，38:88-89.

3 Yang XD(楊曉東)，Xiao SM(肖珊美)，Han Z(韓錚)，et al.GC-MS analysis of volatile components in bayberry(Myricarubra)fruit.J Fruit Sci(果樹學(xué)報)，2008，25:244-249.

4 Li PP(李培培)，Qi XY(戚向陽)，Luo T(羅彤)，et al.Antioxidant activity of flavonoids extracts from different varieties of Chinese bayberry by chemiluminescence.J Chin Inst Food Sci Technol(中國食品學(xué)報)，2011，11:191-194.

5 Zhou JJ(周建儉).Study on the application of nisin in preserving Myricarubra fruits.Jiangsu Agric Sci(江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué))，2012，40:238-240.

6 Liu N(劉寧)，Li ZF(李正芬).Studies on germplasm resources of Myrica nana Cheval in Guizhou province.Seed(種子)，2004，23:80-82.

7 Qin H(秦紅)，Song QQ(宋慶慶)，Hua XY(華曉燕).Bacteriostatic effect of waxberry wine on intestinal bacteria.Guizhou Agric Sci(貴州農(nóng)業(yè)科學(xué))，2012，40:157-159.

8 Sun SL(孫石磊)，Yao WR(姚衛(wèi)蓉).Antibacterial activity of different extracts from Chinese waxberry fruit.Chin J Microecol(中國微生態(tài)學(xué)雜志)，2009，21:229-231.

9 Wu WB(吳文彬)，Wang BJ(王白娟).Study on extraction and activity of polyphenol in Myricaruba(Lour.)Zucc.In Yunan.Chinese Hortic Abstr(中國園藝文摘)，2010，11:5-8.

10 Wang XQ(王賢親)，Pan XJ(潘曉軍)，Lin D(林丹)，et al.Analysis of the essential oil from the leaves of ding-ao MyricaRubraby GC-MS.Food Res Dev(食品研究與開發(fā))，2009，30:98-99.

11 Zhao MC(趙滿倉)，Wei WQ(魏文青)，Liu J(劉晶)，et al.Study on the influencing factors of the MTT based tumor chemosensitivity assay in vitro.Chinese Clin Oncol(臨床腫瘤學(xué)雜志)，2009，14:306-308.

12 Huang F(黃菲)，Luo M(羅曼).Evaluation of methyl thiazolyltetrazolium(MTT)assay for screening antitumor essential oils.Food Sci(食品科學(xué))，2009，30:75-79.

13 Li MY(李明勇)，Huang PC(黃培春)，Kong X(孔霞).Detecting the anticancer effects of Squillaoratoria extract in vitro by MTT method.J Mod Oncol(現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué))，2005，13:336-337.