阿納其根脂肪酸成分分析及其對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B 抑制作用研究

古麗娜爾·卡斯木，馬慶苓，古麗米熱·卡哈爾，阿吉艾克拜爾·艾薩*

1 新疆醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，烏魯木齊 830054;2 中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所干旱區(qū)植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3新疆特有藥用資源利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，烏魯木齊 830011

維藥阿納其根［Anacyclus pyrethrum (L)DC］為菊科植物除蟲(chóng)菊的干燥根，具有清除異常粘液質(zhì)，開(kāi)滯止痛的功效，其性味為三級(jí)末四級(jí)首干熱［1-3］。在維吾爾醫(yī)中，阿納其根常被用來(lái)治療白癜風(fēng)［4］，但是其活性成分及其作用機(jī)理還不清楚;另?yè)?jù)《維吾爾藥志》［5］記載，阿納其根中含有黃酮、墻草堿、菊糖，揮發(fā)油、鞣質(zhì)及氨基酸。其脂肪酸化學(xué)成分及其生物活性的研究未見(jiàn)深入報(bào)道。GC-MS 聯(lián)用作為一種新技術(shù)，具有準(zhǔn)確、方便快捷的特點(diǎn)，在進(jìn)行油脂和揮發(fā)性成分的測(cè)定中得到廣泛的應(yīng)用，成為一種國(guó)際通用的油脂脂肪酸測(cè)定方法［6］。為了進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用阿納其根食用和藥用價(jià)值，本論文利用索氏提取法從阿納其根中提取油脂，經(jīng)甲酯化處理后，用氣相色譜質(zhì)譜法(GC/MS)對(duì)脂肪酸組成進(jìn)行了分析和鑒定;同時(shí)對(duì)其進(jìn)行蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)的抑制作用研究，以期為阿納其根的深入研究提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

阿納其根:購(gòu)于巴基斯坦，由經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院藥劑科主任鑒定為菊科植物除蟲(chóng)菊［Anacyclus pyrethrum(L)DC］的干燥根;其余試劑均為分析純。

GC-MS Agilent 7890A-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司);BP211D 型電子天平(德國(guó)Sartorius 有限公司);HH-W600 三用恒溫水箱(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠);SpectraMax M5 型酶標(biāo)儀;平底96 孔ELISA 板。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

稱取30 g 阿納其根3 份，分別加入正己烷、乙醚、氯仿各80 mL，索氏提取法提取5 h，減壓回收溶劑，得淡黃色油狀液體。

稱取油樣0.1 g，置50 mL 錐形瓶中，加0.5 mol/L 氫氯化鉀甲醇溶液2 mL，在65 ℃水浴中加熱回流30 min，放冷，加15%三氟化硼甲醇溶液2 mL，在65 ℃水浴中加熱回流30 min，放冷，加庚烷4 mL，繼續(xù)在65 ℃水浴中加熱回流5 min 后，放冷，加飽和氯化鈉溶液10 mL 洗滌，搖勻，靜置使分層，取上層液，用水洗滌3 次，每次2 mL，上層液經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，合并上清液于小瓶中待測(cè)。

1.2.2 GC-MS 分析

色譜條件:HP-5MS 毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm);升溫程序:起始溫度為150 ℃，以2 ℃/min 的速率程序升溫至220 ℃，保持5 min，以10℃/min 升溫至250 ℃。進(jìn)樣口溫度:260 ℃;載氣:99.999% He;流速:1.0 mL/min;壓力96.1 kPa;進(jìn)樣量1 μL;分流比20∶1。

質(zhì)譜條件:電子轟擊(EI)離子源;電子能量70 eV;離子源溫度:230 ℃，質(zhì)量掃描范圍:30～350 amu。分流比:150∶1。

取1.2.1 項(xiàng)下制備所得上清液0.1 μL 進(jìn)行測(cè)定，按峰面積歸一化法計(jì)算化學(xué)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。所得質(zhì)譜圖采用Nist147 譜庫(kù)及Wiley7 譜庫(kù)進(jìn)行檢索。

1.2.3 PTP1B 抑制作用研究

按照文獻(xiàn)［7］方法，即三種不同溶劑(正己烷、乙醚、氯仿)提取的樣品用適量DMSO 溶解，反應(yīng)體系中緩沖液(pH 7.0，1 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaCl，20 mmol/L HEPES)，0.09 μmol/L his-PTP1B1-3211 μL，35 mmol/L pNPP，總體積為200 μL。室溫孵育10 min，再加入pNPP 20 μL，室溫孵育30 min 后，用3 mol/L NaOH 10 μL 終止反應(yīng)。在405 nm 處測(cè)定吸收值，以不含酶溶液體系為空白對(duì)照。

IC50值的確定:按上述活性測(cè)定方法，提取物用DMSO 溶解，按不同劑量加入，405 nm 處測(cè)定吸收值，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。按抑制率=(OD405空白-OD405樣品)/OD405空白×100%，計(jì)算不同濃度的抑制率。應(yīng)用Origin 軟件計(jì)算IC50值。以此判斷阿納其根脂肪酸對(duì)PTP1B 的抑制能力。

2 結(jié)果與討論

2.1 阿納其根油脂肪酸成分分析

按照1.2.2 項(xiàng)所述條件，測(cè)得阿納其根用正己烷提取油脂脂肪酸甲酯的GC-MS 總離子流色譜圖(TIC)，脂肪酸甲酯成分有8 種;用乙醚提取油脂脂肪酸甲酯的氣相色譜-質(zhì)譜總離子流色譜圖(TIC)，脂肪酸甲酯成分有12 種;脂肪酸甲酯成分有8 種;用氯仿提取油脂脂肪酸甲酯的氣相色譜-質(zhì)譜總離子流色譜圖(TIC)，脂肪酸甲酯成分有5 種;見(jiàn)圖1～圖3，見(jiàn)表1～表3。

圖1 阿納其根正己烷提取油脂脂肪酸甲酯GC-MS 總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram (TIC)of fatty acid component of A.pyrethrum extracted by n-hexane

表1 阿納其根正己烷提取油脂脂肪酸甲酯成分和含量Table 1 Main components of fatty acids of A.pyrethrum extracted by n-hexane

圖2 阿納其根乙醚提取油脂脂肪酸甲酯GC-MS 總離子流圖Fig.2 GC-MS TIC of fatty acid component of A.pyrethrum extracted by diethyl ether

圖3 阿納其根氯仿提取油脂脂肪酸甲酯GC-MS 總離子流圖Fig.3 GC-MS TIC of fatty acid component of A.pyrethrum extracted by chloroform

表2 阿納其根乙醚提取油脂脂肪酸甲酯成分和含量Table 2 Main components of fatty acids of A.pyrethrum extracted by diethyl ether

由表1～表3 可知，阿納其根脂肪酸中主要成分有亞油酸為、棕櫚酸、油酸，亞麻酸等。其中亞油酸和棕?cái)R酸不飽和脂肪酸的含量較高，可達(dá)60%以上，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。亞麻酸和亞油酸是人體必需脂肪酸，且無(wú)法由人體自行合成，必須從食物中攝取獲得［8］。抑制缺血性心血管疾病等方面起重要作用［9］。由此可見(jiàn)，阿納其根油是很好的保健食品，具有較高食用藥用價(jià)值。

表3 阿納其根氯仿提取油脂脂肪酸甲酯成分和含量Table 3 Main components of fatty acids of A.pyrethrum extracted by chloroform

2.2 PTP1B 抑制作用的研究

將得到的阿納其根3 種溶劑提取油脂脂肪酸進(jìn)行PTP1B 抑制作用的研究。結(jié)果表明，阿納其根脂肪酸對(duì)PTP1B 有較強(qiáng)的抑制作用，正己烷提取脂肪酸IC50值為5.27±0.40 μg/mL;乙醚提取脂肪酸IC50值為4.71±0.08 μg/mL;氯仿提取脂肪酸IC50值為7.01±1.98 μg/mL。

3 結(jié)論

在阿納其根3 種溶劑提取油脂脂肪酸中主要成分為亞油酸、棕櫚酸、油酸、亞麻酸。而且其正己烷提取脂肪酸、乙醚提取脂肪酸、氯仿提取脂肪酸對(duì)PTP1B 抑制作用的IC50值分別為5.27±0.40、4.71±0.08、7.01±1.98 μg/mL，都對(duì)PTP1B 有較強(qiáng)的抑制作用。

阿納其根中亞麻酸、亞油酸和棕?cái)R酸含量較多，具有良好的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。本文為維藥阿納其根在食品及藥用產(chǎn)品領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)提供了一定理論依據(jù)，并為阿納其根的深入研究和資源利用奠定了基礎(chǔ)。

1 Ministry of Health Pharmacopoeia Commission(中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì)).Republic of China Ministry of Health Drug Standards·Uygur Medicine Branch(中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·維吾爾藥分冊(cè)).Urumqi:Xin-jiang Science and Technology Publishing House，1999.43.

2 Xinjiang Uygur Autonomous Region Health Department Compiled(新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生廳編).Uygur Medicine Standards(維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)).Urumqi:Xinjiang Science and Technology Publishing House，1993.143-144.

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