白藜蘆醇對(duì)高脂膳食肥胖及肥胖抵抗小鼠抗氧化與淋巴細(xì)胞亞群免疫功能調(diào)節(jié)的研究

王 斌，孫 進(jìn)，李祥輝，施用暉，樂(lè)國(guó)偉*

1江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2 江南大學(xué)食品學(xué)院，無(wú)錫 214122

肥胖作為世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問(wèn)題，同時(shí)與心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化等慢性病密切相關(guān)［1］。長(zhǎng)期高脂膳食是導(dǎo)致肥胖發(fā)生的重要因素，并伴有氧化應(yīng)激和慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生［2］。然而有研究指出同一品系動(dòng)物相同高脂膳食的情況下，有些動(dòng)物發(fā)生肥胖，被稱為肥胖表型，有些動(dòng)物不發(fā)生肥胖，被稱為肥胖抵抗表型［3］。白黎蘆醇(R)是一種非黃酮類多酚化合物，其主要在減肥、保護(hù)心血管以及減輕炎癥損傷等方面發(fā)揮重要作用［4］。但白藜蘆醇對(duì)高脂膳食肥胖及肥胖抵抗小鼠氧化應(yīng)激和淋巴細(xì)胞免疫功能紊亂的調(diào)節(jié)作用目前尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)以高脂日糧長(zhǎng)期飼喂小鼠，研究白藜蘆醇對(duì)高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠降血脂、抗氧化作用與淋巴細(xì)胞亞群免疫功能調(diào)節(jié)的影響。探討白藜蘆醇抗氧化活性與淋巴細(xì)胞亞群免疫調(diào)節(jié)功能之間的關(guān)系，為進(jìn)一步闡明白藜蘆醇對(duì)高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

白藜蘆醇(上海諾特生物科技有限公司);單抗試劑:PE-Cy5 anti-mouse CD3e(克隆號(hào):145-2C11)、FITC anti-mouse CD4(L3T4)(克隆號(hào):GK1.5)、PE anti-mouse CD8a(Ly-2)(克隆號(hào):53-6.7)、PE-Cy7 anti-mouse CD25(克隆號(hào):PC61.5)、APC anti-mouse FoxP3(克隆號(hào):FJK-16s)(美國(guó)eBioscience 公司);固定劑、破膜劑(美國(guó)eBioscience 公司);EZ-SepTMMouse 1X 淋巴細(xì)胞分離液(深圳市達(dá)科為生物技術(shù)有限公司);其余試劑均為分析純。

UV1100 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京瑞利科學(xué)儀器有限公司)，Multiskan Mk3 酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo 公司)，F(xiàn)ACSCalibur 流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用6 周齡雄性C57BL/6 小鼠72 只(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)有限責(zé)任公司)，一周預(yù)飼后，按體重隨機(jī)分成2 組:即Control 組(正常日糧)8 只，HFD 組(高脂日糧)64 只，飼喂13 周后，HFD 組小鼠根據(jù)體重由高到低排序，將體重最高的前16 只小鼠作為肥胖(DIO)組，其平均體重顯著高于Control 組小鼠體重，將體重最低的后16 只小鼠作為肥胖抵抗(DR)組，其平均體重與Control 組小鼠無(wú)顯著性差異。HFD 組剩余32 只小鼠從本實(shí)驗(yàn)中剔除［5］。而后將DIO 組與DR 組小鼠各自隨機(jī)分兩組，每組8 只，分別飼喂高脂日糧、高脂日糧+0.06%白藜蘆醇［6，7］(高脂日糧中白藜蘆醇的添加劑量為0.06%，混合后制粒)13 周，自由采食。日糧配方見(jiàn)表1。每周稱體重1 次，飼養(yǎng)結(jié)束后，各組小鼠隔夜禁食12 h，乙醚麻醉小鼠后，摘眼球取血，肝素抗凝，一部分抗凝血用于淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)，另一部分抗凝血4000 rpm 離心15 min，取上層抗凝血漿，用于血脂檢測(cè)。斷頸椎處死小鼠，取出脾臟，一部分脾臟研磨制成10%組織勻漿，4000 rpm 離心15 min，取脾臟勻漿上清液用于抗氧化酶活性、MDA 含量檢測(cè)。另一部分脾臟研磨后，用于脾臟淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)。

1.2.2 血脂含量檢測(cè)

血漿甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)按神州英諾華公司試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 抗氧化酶活性及MDA 含量檢測(cè)

總抗氧化能力(T-AOC)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)按南京建成生物工程研究所試劑盒進(jìn)行測(cè)定;谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)采用DTNB 比色法測(cè)定［8］。

表1 實(shí)驗(yàn)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)組成Table 1 Formula and nutrients content of the diet (%)

1.2.4 外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)

小鼠眼球取血后，每個(gè)樣本取200 μL 抗凝血，紅細(xì)胞裂解液后，平均加入到2 個(gè)上樣管中，一管避光分別標(biāo)記CD3+、CD4+、CD8+單抗(按試劑說(shuō)明書(shū)加量)，混勻，室溫避光孵育30 min 后，PBS 洗1次，0.5 mL PBS 重懸細(xì)胞，混勻后上機(jī)檢測(cè)外周血CD3+CD4+和CD3+CD8+細(xì)胞含量。一管避光標(biāo)記CD4+和CD25+單抗(按試劑說(shuō)明書(shū)加量)，混勻，室溫避光孵育30 min，PBS 洗1 次，加入固定劑，破膜劑，孵育15 min 后，加入FoxP3+單抗，室溫避光孵育30 min，PBS 洗1 次，0.5 mL PBS 重懸細(xì)胞，混勻后上機(jī)檢測(cè)外周血CD4+CD25+FoxP3+Tregs 細(xì)胞含量。

1.2.5 脾臟淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)

取小鼠新鮮脾臟于不銹鋼網(wǎng)上剪碎，加入4 mL淋巴細(xì)胞分離液，用注射器活塞研磨，制備脾細(xì)胞懸液后，加入1 mL RPMI1640 培養(yǎng)基，2500 rpm 離心30 min，吸出淋巴細(xì)胞層，加入10 mL 1640 培養(yǎng)基洗滌一次，PBS 重懸細(xì)胞，每個(gè)樣本取200 μL 單細(xì)胞懸液平均加入到2 個(gè)上樣管中，一管避光標(biāo)記CD3+、CD4+、CD8+單抗(按試劑說(shuō)明書(shū)加量)，混勻，室溫避光孵育30 min，PBS 洗1 次，0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，混勻后上機(jī)檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞CD3+CD4+和CD3+CD8+細(xì)胞含量。一管避光標(biāo)記CD4+和CD25+單抗(按試劑說(shuō)明書(shū)加量)，混勻，室溫避光孵育30 min，PBS 洗1 次，加入固定劑，破膜劑，孵育15 min 后，加入FoxP3+單抗，室溫避光孵育30 min，PBS 洗1 次后，0.5 mL PBS 重懸細(xì)胞，混勻后上機(jī)檢測(cè)脾臟CD4+CD25+FoxP3+Tregs 細(xì)胞含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法

利用CELLQuest 軟件分析流式細(xì)胞儀上獲取的淋巴細(xì)胞亞群數(shù)據(jù)。采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件中的one-way ANOVA 方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較、差異顯著性檢驗(yàn)分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠體重的影響

高脂飼喂13 周后，肥胖小鼠體重顯著高于正常小鼠(P＜0.05)，肥胖抵抗小鼠體重與正常小鼠差異不顯著。高脂飼喂26 周后，肥胖小鼠體重顯著高于正常小鼠(P＜0.05)，肥胖抵抗小鼠體重與正常小鼠體重?zé)o顯著性差異。肥胖+R 組小鼠體重較肥胖小鼠有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 白藜蘆醇對(duì)高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠體重的影響(n=8，)Fig.1 Effects of resveratrol on the body weight of diet-induced obese (DIO)and diet-resistant (DR)mice (n=8，)

2.2 白藜蘆醇對(duì)高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠血脂的影響

由表2 可見(jiàn)，與正常小鼠相比，肥胖小鼠血漿TG、TC、LDL-C 含量顯著增高(P＜0.05)，HDL-C 含量較正常組有所升高，但差異不顯著(P＞0.05)。白藜蘆醇的添加可顯著降低肥胖小鼠血漿TG、TC、LDL-C 含量(P＜0.05)。肥胖抵抗小鼠與正常小鼠相比，其血漿TC、LDL-C 含量顯著升高(P＜0.05)，TG、HDL-C 含量較正常小鼠差異不顯著。添加白藜蘆醇對(duì)肥胖抵抗小鼠血脂無(wú)顯著性影響。

表2 白藜蘆醇對(duì)高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠血脂的影響(n=8，)Table 2 Effects of resveratrol on plasma lipid status of diet-induced obese (DIO)and diet-resistant (DR)mice (n=8，)

表2 白藜蘆醇對(duì)高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠血脂的影響(n=8，)Table 2 Effects of resveratrol on plasma lipid status of diet-induced obese (DIO)and diet-resistant (DR)mice (n=8，)

注:* P＜0.05，與正常小鼠比較;#P＜0.05，與肥胖小鼠比較。下表同。Note * P＜0.05 vs Control mice;#P＜0.05 vs DIO mice.Same as below.

2.3 白藜蘆醇對(duì)高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠脾臟抗氧化酶活性及MDA 含量的影響

如圖2 可知，與正常小鼠相比，肥胖與肥胖抵抗小鼠脾臟CAT、GSH-Px 活性及總抗氧化能力顯著降低(P＜0.05)，肥胖小鼠脾臟MDA 含量顯著升高(P＜0.05)。白藜蘆醇的添加能夠提高肥胖與肥胖抵抗小鼠脾臟CAT、GSH-Px 活性及總抗氧化能力，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，肥胖+R 組小鼠脾臟MDA 含量較肥胖小鼠顯著降低(P＜0.05)。

圖2 白藜蘆醇對(duì)高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠脾臟抗氧化酶活性及MDA 含量的影響(n=8，)Fig.2 Effects of resveratrol on the antioxidant enzyme activities and MDA in the spleen of diet-induced obese (DIO)and diet-resistant (DR)mice (n=8，)

2.4 白藜蘆醇對(duì)高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠外周血和脾臟淋巴細(xì)胞亞群的影響

由表3 可見(jiàn)，肥胖小鼠外周血與脾臟CD3+CD4+/CD3+CD8+比值較正常小鼠顯著降低(P＜0.05)，肥胖抵抗CD3+CD4+/CD3+CD8+比值相比正常小鼠有所降低，但差異不顯著(P＞0.05)。白藜蘆醇的添加能夠增加肥胖與肥胖抵抗小鼠外周血與脾臟CD3+CD4+/CD3+CD8+比值(P＞0.05)。與正常小鼠相比，肥胖小鼠外周血與脾臟Tregs 細(xì)胞含量顯著降低(P＜0.05)，肥胖抵抗小鼠脾臟Tregs 細(xì)胞含量顯著降低(P＜0.05)。白藜蘆醇的添加能夠增加肥胖(P＜0.05)與肥胖抵抗(P＞0.05)小鼠Tregs 細(xì)胞含量。

3 討論

白藜蘆醇是一種天然的多酚類化合物，存在于葡萄、花生、虎杖等植物中，具有廣泛的生物學(xué)和藥理學(xué)活性。本實(shí)驗(yàn)中，13 周高脂膳食引起肥胖小鼠體重顯著高于正常小鼠，肥胖抵抗小鼠體重與正常小鼠無(wú)顯著性差異。高脂飼喂26 周后，肥胖小鼠體重顯著高于正常小鼠，白藜蘆醇添加13 周可降低肥胖小鼠體重。TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平是反映機(jī)體脂質(zhì)代謝的重要指標(biāo)。長(zhǎng)期高脂膳食引起機(jī)體血脂代謝異常，造成高脂血癥［9］。本實(shí)驗(yàn)肥胖小鼠血漿TG、TC、LDL-C 含量顯著升高，HDL-C 含量有所升高，引起肥胖小鼠高血脂和氧化應(yīng)激。肥胖抵抗小鼠血漿TC、LDL-C 含量較正常小鼠顯著升高，較肥胖小鼠有所降低。白藜蘆醇的添加可顯著降低肥胖小鼠血漿TG、TC、LDL-C 含量，從而改善血脂代謝紊亂，并且其對(duì)于肥胖小鼠的降血脂效果好于肥胖抵抗小鼠。

表3 白藜蘆醇對(duì)高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠外周血和脾臟淋巴細(xì)胞亞群的影響(n=8，)Table 3 Effects of resveratrol on the lymphocyte subsets of peripheral blood and spleen of diet-induced obese (DIO)and diet-resistant(DR)mice(n=8，)

表3 白藜蘆醇對(duì)高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠外周血和脾臟淋巴細(xì)胞亞群的影響(n=8，)Table 3 Effects of resveratrol on the lymphocyte subsets of peripheral blood and spleen of diet-induced obese (DIO)and diet-resistant(DR)mice(n=8，)

為了更好的維持機(jī)體穩(wěn)定，人體內(nèi)存在天然的抗氧化系統(tǒng)。CAT、GSH-Px 是兩種體內(nèi)重要的抗氧化酶，正常情況下，可及時(shí)清除體內(nèi)氧化代謝產(chǎn)物，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，當(dāng)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平過(guò)高時(shí)，其活力下降，引起氧化與抗氧化之間的失衡，引發(fā)一系列代謝性疾?。?0］?？偪寡趸芰κ菍?duì)機(jī)體非酶性抗氧化能力的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)。機(jī)體非酶系統(tǒng)產(chǎn)生的自由基可攻擊生物膜的多不飽和脂肪酸產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物如MDA 等，引起細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)中肥胖與肥胖抵抗小鼠脾臟抗氧化酶CAT、GSH-Px 活性顯著下降，TAC 顯著降低，肥胖小鼠脾臟脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA 含量顯著升高。肥胖小鼠的抗氧化能力低于肥胖抵抗小鼠。肥胖與肥胖抵抗小鼠抗氧化能力降低與血脂水平升高相對(duì)應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)氧化應(yīng)激/脂質(zhì)過(guò)氧化參與高脂膳食誘發(fā)的血脂代謝紊亂的發(fā)生、發(fā)展。有研究表明，白藜蘆醇通過(guò)增加Mn-SOD 的含量和活性以提高高脂膳食小鼠抗氧化能力［11］。Fukui 等［12］發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇選擇性的誘導(dǎo)線粒體SOD 的表達(dá)，進(jìn)而減少線粒體的氧化應(yīng)激，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受谷氨酸鹽和過(guò)氧化氫造成的細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)中，白藜蘆醇添加對(duì)抗氧化酶及總抗氧化能力的調(diào)節(jié)作用不顯著，但能夠顯著降低肥胖小鼠脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA 含量，從而進(jìn)一步證明白藜蘆醇通過(guò)緩解長(zhǎng)期高脂膳食引起機(jī)體氧化應(yīng)激，從而減少脂質(zhì)沉積［13］，同時(shí)改善高脂膳食引起的肥胖小鼠血脂代謝紊亂。

長(zhǎng)期高脂膳食誘導(dǎo)肥胖，伴隨著慢性炎性反應(yīng)，從而損害機(jī)體免疫功能［14］。T 淋巴細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，不同淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量和功能發(fā)生異常時(shí)，可導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫功能紊亂。CD3+CD4+/CD3+CD8+比值減少是免疫缺陷的重要指征。本次實(shí)驗(yàn)中，高脂肥胖小鼠外周血與脾臟中CD3+CD4+/CD3+CD8+比值相比正常小鼠顯著降低，肥胖抵抗小鼠較正常小鼠差異不顯著。提示肥胖小鼠機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)，表明氧化應(yīng)激抑制細(xì)胞免疫功能。白藜蘆醇的添加能夠提高肥胖與肥胖抵抗小鼠CD3+CD4+/CD3+CD8+比值，協(xié)調(diào)免疫細(xì)胞間的相互作用，緩解機(jī)體的免疫抑制狀態(tài)。

CD4+CD25+FoxP3+Tregs 細(xì)胞是一群抑制功能強(qiáng)大的T 細(xì)胞亞群，通過(guò)下調(diào)對(duì)自身或非己抗原的免疫反應(yīng)，在機(jī)體免疫耐受和免疫穩(wěn)態(tài)維持中起重要作用。Tregs 細(xì)胞在調(diào)節(jié)肝臟炎性反應(yīng)中起重要作用，有研究表明，高脂膳食小鼠肝臟Tregs 細(xì)胞數(shù)量降低，而恢復(fù)正常膳食的同時(shí)伴隨著Tregs 細(xì)胞數(shù)量的增加［15］。Tregs 細(xì)胞還與肥胖的發(fā)生密切相關(guān)，肥胖而非肥胖抵抗小鼠脂肪組織中Tregs 細(xì)胞數(shù)量降低［16］。本實(shí)驗(yàn)中，肥胖小鼠外周血與脾臟Tregs 細(xì)胞數(shù)量較正常小鼠顯著降低，肥胖抵抗小鼠脾臟Tregs 細(xì)胞數(shù)量顯著降低，外周血Tregs 細(xì)胞數(shù)量較正常小鼠差異不顯著。高脂膳食引起肥胖小鼠Tregs 細(xì)胞數(shù)量的降低進(jìn)一步說(shuō)明高脂膳食性氧化應(yīng)激與肥胖伴隨著機(jī)體慢性炎性反應(yīng)的發(fā)生。白藜蘆醇在抗炎以及抗菌方面發(fā)揮重要作用［17］。有研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過(guò)減少脂肪形成以及抗炎作用來(lái)抑制肥胖的發(fā)生［18］。本實(shí)驗(yàn)中，白藜蘆醇的添加能夠增加肥胖與肥胖抵抗小鼠外周血Tregs 細(xì)胞數(shù)量，顯著增加肥胖小鼠脾臟Tregs 細(xì)胞數(shù)量，說(shuō)明白藜蘆醇通過(guò)增加Tregs 細(xì)胞數(shù)量，緩解高脂膳食性氧化應(yīng)激以及肥胖對(duì)機(jī)體造成的慢性炎性損傷。

高脂膳食可引起機(jī)體血脂代謝紊亂，誘發(fā)肥胖、糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化等一系列疾病的發(fā)生，而高脂血癥和肥胖的形成是具有慢性炎癥反應(yīng)特征的病理過(guò)程，從而造成機(jī)體的免疫功能損傷。因此預(yù)防高脂膳食引起的免疫損傷是維持機(jī)體平衡、調(diào)節(jié)免疫功能紊亂的重要措施。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，高脂膳食肥胖小鼠血脂升高，誘發(fā)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致外周血和脾臟淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量異常和平衡失調(diào)，機(jī)體免疫功能受損，肥胖抵抗小鼠抗氧化與淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)功能好于肥胖小鼠。有研究表明，高脂膳食引起機(jī)體氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)肝臟Tregs 細(xì)胞凋亡與炎性反應(yīng)的發(fā)生［19］，說(shuō)明機(jī)體的氧化還原狀態(tài)對(duì)于免疫功能調(diào)節(jié)起重要的作用。本實(shí)驗(yàn)中，白藜蘆醇作為一種天然抗氧化劑能夠緩解高脂膳食對(duì)肥胖小鼠免疫功能的損傷，其原因可能是白藜蘆醇通過(guò)降低血脂，減少脂質(zhì)過(guò)氧化，緩解高脂膳食對(duì)免疫細(xì)胞的氧化損傷，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞亞群功能，從而改善機(jī)體免疫功能紊亂，與此同時(shí)這也為高脂膳食性肥胖引發(fā)機(jī)體免疫功能損傷疾病提供新的解決方案。

高脂飲食是導(dǎo)致人類和嚙齒類動(dòng)物肥胖發(fā)生的重要因素，但并不能導(dǎo)致所有人和嚙齒類動(dòng)物發(fā)生肥胖。有研究表明，高脂膳食引起肥胖而非肥胖抵抗小鼠糖代謝紊亂及內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)［20，21］，同時(shí)也有研究表明兩組小鼠血糖以及血脂水平無(wú)顯著性差異［22］。本實(shí)驗(yàn)中肥胖抵抗小鼠與肥胖小鼠相比，其血脂水平無(wú)顯著性差異，但其抵抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力以及淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)功能好于肥胖小鼠，說(shuō)明在高脂膳食情況下，肥胖抵抗小鼠相比肥胖小鼠具有較好的緩解氧化應(yīng)激以及免疫功能損傷的能力。白藜蘆醇的添加對(duì)肥胖抵抗小鼠的調(diào)節(jié)作用相比于肥胖小鼠不顯著，推測(cè)兩組小鼠對(duì)于白藜蘆醇的劑量需求有所不同。因此白藜蘆醇對(duì)于高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠作用的劑量效應(yīng)還有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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