HPLC 法測定神安顆粒中五味子醇甲含量的研究

易延逵，蔡光先，楊永華

1南方醫(yī)科大學(xué)，廣州 510515;2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙 410006

神安顆粒是湖南中醫(yī)藥大學(xué)蔡光先教授的經(jīng)驗(yàn)方，由天麻、酸棗仁、丹參、首烏藤、百合花、五味子等6 味藥組成，功能益氣養(yǎng)血、疏郁定驚、清心除煩、補(bǔ)腦安眠。用于各種慢性疾病引起的頭昏眼花、心神焦悴、失眠多夢、記憶力減退、疲倦無力等。安神原方應(yīng)用方法為:天麻、酸棗仁、丹參、首烏藤、百合花、五味子等各味粉碎成粗粉，開水泡服。很明顯，原方應(yīng)用不方便，服用量大，服用困難，口感苦澀。鑒于神安顆粒藥方療效確切、應(yīng)用廣泛及市面已有劑型的特點(diǎn)與現(xiàn)代人們用藥的要求，我們選擇神安處方為研究載體，對原工藝進(jìn)行改進(jìn)，采用超細(xì)粉體技術(shù)及現(xiàn)代提取工藝等現(xiàn)代制藥工藝，研制神安顆粒制劑，在保持傳統(tǒng)中醫(yī)藥特色的基礎(chǔ)上，大量采用現(xiàn)代制藥技術(shù)，提高藥物的生物利用度。

在對中藥質(zhì)量控制的研究中，我們提出了應(yīng)對中藥進(jìn)行多指標(biāo)質(zhì)量控制，即根據(jù)中藥制劑的成分分析、制備工藝及其與功能主治、相關(guān)藥效作用等，確定中藥所含有的具體各類成分，進(jìn)而根據(jù)每一類成分的提取方法和儀器條件制定出相應(yīng)的含量測定指標(biāo)。神安顆?；竟に嚍樘炻榉鬯槌晌⒎?丹參、五味子、百合花加90%乙醇滲漉提取其極性較小脂溶性成分;丹參、五味子、百合花醇提后藥渣與酸棗仁、夜交藤加水提取，最后加入適量輔料制成顆粒。用于各種原因引起的心胸?zé)┰辏叨鄩?，頭昏乏力，記憶力減退等癥狀。根據(jù)神安顆粒的組成、功能主治和工藝，綜合考慮，主要含有三類成分，一是貴細(xì)藥材天麻經(jīng)過超微粉碎直接入藥，故含有以天麻素為指標(biāo)性成分的天麻苷類成分;二是五味子、丹參等采用高濃度醇提，含有以五味子醇甲、丹參酮ⅡA為指標(biāo)性成分的脂溶性成分;三是各藥材經(jīng)過水提，含有多量的水溶性成分，以丹參素、斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B 等為指標(biāo)性成分。本文采用HPLC 建立以五味子醇甲為指標(biāo)性成分的脂溶性成分的含量測定方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 高效液相色譜儀(HPLC);色譜柱:Kromasil C18柱(4.6 mm ×150 mm，5.0 μm);處理軟件:ChemStation 數(shù)據(jù)處理軟件。UV-2401 可見紫外分光光度儀(日本島津);電子天平(0.001g，德國Sartrius BP110S)。

五味子醇甲對照品(批號:110857-200709，由中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用);神安顆粒(自制);甲醇為色譜純，水為重蒸水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

參照有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［4-10］，選擇HPLC 法測定五味子醇甲含量，并進(jìn)行了方法學(xué)考察。

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

流動相:甲醇-水(60∶40);檢測波長為250 nm。理論板數(shù)按五味子醇甲峰計(jì)算不低于2000。

2.2 檢測波長的選擇

根據(jù)五味子醇甲的理化性質(zhì)，在紫外區(qū)域有最大吸收，故取五味子醇甲對照品，采用甲醇配成約0.3 mg/mL 的溶液，在200～400 nm 波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果五味子醇甲在250 nm 波長處有最大吸收，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，可作為HPLC 法測定五味子醇甲含量的檢測波長。

2.3 供試品溶液制備方法的比較

取神安顆粒0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，分別超聲處理(功率:240W，頻率:45Hz)10 min、30 min、1 h，放冷，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。測定，計(jì)算，結(jié)果見表1。從表1 中可見，以超聲提取30 min 為宜。

表1 不同提取時間對五味子醇甲含量的影響Table 1 Effect of different time to the content of Schisandrin

2.4 對照品溶液的制備

取五味子醇甲對照品15 mg，精密稱定，置100 mL 棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得(每mL 中含五味子醇甲0.15 mg)。

2.5 測定法

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定。在選定條件下，五味子醇甲峰與樣品中其它組分色譜峰可達(dá)基線分離，按五味子醇甲峰計(jì)算，理論板數(shù)在2000 以上，對照品、供試品色譜圖分別見附圖1(A、B)。

圖1 五味子醇甲對照品(A)、神安顆粒樣品(B)及陰性對照(C)的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of schisandrin standard (A)，Shenan granules sample (B)and blank (C)

2.6 專屬性考查

按處方配比稱取除五味子以外的其他藥材適量，按制備工藝制成缺五味子的陰性樣品，同法制備缺五味子的陰性樣品溶液。按“2.5”項(xiàng)所述測定法測定，即得陰形樣品色譜圖，結(jié)果見附圖1(C)。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 線性范圍

精密吸取對照品溶液1、5、10、20、40 μL，按上述色譜條件測定峰面積，以進(jìn)樣量(μL)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為:Y=1923.4X +2.1234，R2=1.000。結(jié)果表明五味子醇甲在0.15～6.0 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液10 μL，分別進(jìn)樣6 次，依法測定，結(jié)果RSD 值為1.98%。表明本方法精密度較好。

2.7.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、12、24 h進(jìn)行測定，結(jié)果24h 內(nèi)峰面積RSD 值為2.77%。表明供試品溶液在24 h 內(nèi)峰面積值基本穩(wěn)定。

2.7.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品6 份，同法制備供試品溶液，依法測定，結(jié)果RSD 值為2.86%。表明本方法重復(fù)性較好。

2.7.5 加樣回收率試驗(yàn)

取已測定含量的樣品適量，共6 份，精密稱定，分別加入五味子醇甲對照品溶液1 mL(0.13 mg/mL)，即0.13 mg，按供試品溶液的制備方法處理，測定峰面積，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 回收率測定結(jié)果Table 2 Results of recovery determining

結(jié)果表明，本方法加樣回收率較好。

2.7.6 對照品純度檢查

取濃度為50 μg/mL 的五味子醇甲對照品溶液30 μL，按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測定項(xiàng)下的方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果檢出其純度為99.5%。

2.8 樣品含量測定

取樣品三批，依法進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表3。

表3 三批樣品含量測定結(jié)果Table 3 Quantification results of schisandrin in 3 batch’s sample

2.9 藥材中五味子醇甲含量測定試驗(yàn)

取五味子藥材三批，按《中國藥典》2010年版一部天麻項(xiàng)下含量測定方法檢驗(yàn)，結(jié)果其五味子醇甲含量分別為0.5779%、0.6008%、0.5516%，液相色譜圖見圖2。

用五味子醇甲含量為0.5779%的藥材投料試制樣品，結(jié)果含量為1.255 mg/g。經(jīng)計(jì)算本品轉(zhuǎn)移率為86.87%。《中國藥典》規(guī)定天麻藥材中五味子醇甲含量不得少于0.40%，如采用該含量的藥材投料，按60.0%的轉(zhuǎn)移率計(jì)算，本品中五味子醇甲含量為0.6 mg/g。根據(jù)上述結(jié)果，暫定本品含天麻以五味子醇甲計(jì)，不低于0.600 mg/g。

3 討論與結(jié)論

建立科學(xué)有效的中藥質(zhì)量控制體系，進(jìn)行中藥質(zhì)量的控制研究，一直是中醫(yī)藥研究領(lǐng)域最重要的領(lǐng)域之一。中藥質(zhì)量控制研究也隨著現(xiàn)代分析技術(shù)、儀器設(shè)備制造技術(shù)的發(fā)展而不斷的發(fā)展。我們在對中成藥質(zhì)量控制的研究中，提出了應(yīng)該采用多指標(biāo)控制中成藥的質(zhì)量，應(yīng)該根據(jù)中藥制劑的成分分析、制備工藝及其與功能主治、相關(guān)藥效作用等來確定需要控制的指標(biāo)類成分。

圖2 五味子醇甲對照品(A)及五味子藥材(B)的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of schisandrin standard (A)and Fructus Schisandrae sample (B)

神安顆粒采用了三種工藝，即超微粉碎工藝、醇提工藝、水提工藝，而其原料藥材成分也基本可以分為三類，即以天麻素為指標(biāo)成分的天麻苷類成分;以五味子醇甲、丹參酮ⅡA 為指標(biāo)性成分的脂溶性成分;以丹參素、斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B 等為指標(biāo)性成分的水溶性成分。因而其質(zhì)量控制也應(yīng)建立三類成分的質(zhì)量控制指標(biāo)。

五味子是神安顆粒的主要藥物，也為含脂溶性成分的主要藥物，五味子醇甲為其指標(biāo)成分，2010版中國藥典［4］五味子中五味子醇甲采用的也是高效液相色譜(HPLC)法，為此我們對其進(jìn)行了研究，采用HPLC 法建立其含量測定方法。2010 版中國藥典五味子中五味子醇甲的高效液相色譜含量測定方法中，和有關(guān)文獻(xiàn)采用的有關(guān)條件有一定差異，經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，本文優(yōu)化了神安顆粒中五味子醇甲的含量測定方法，并選擇了供試品溶液的處理方法，結(jié)果樣品分離效果好，測得神安顆粒中五味子醇甲含量約為1.30 mg/g。

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