黑果枸杞中花色苷的提取與結構鑒定

譚 亮，董 琦，曹靜亞，耿丹丹，胡風祖

中國科學院西北高原生物研究所，西寧 810008

黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)系茄科(Solanceae)枸杞屬(Lycium L.)植物［1］，是西北干旱地區(qū)一種特有的多年生灌木野生植物。其耐干旱，生長于鹽堿土荒地、沙地或路旁，可作為水土保持的灌木植物［2］。其果實味甘、性平、清心熱，據(jù)《四部醫(yī)典》中記載，藏醫(yī)將其用于治療心熱病、心臟病、月經(jīng)不調(diào)、停經(jīng)等病癥;民間用作滋補強壯、明目及降壓藥［3-5］。現(xiàn)代藥理學研究表明黑果枸杞中的多糖具有抗疲勞、降血糖［6］等藥理活性;黃酮類化合物具有抗氧化及其他營養(yǎng)保健作用等［7］;原花青素具有抗氧化、抑制腫瘤等功能［8］;花色苷具有抗氧化、抗突變、抑制流感病毒和皰疹病毒［9，10］等活性。其中，花色苷的藥理活性及可作為天然色素的良好來源越來越備受人們的關注，測定方法已有多篇文獻報道，包括有高效液相色譜法、色價法、消光系數(shù)法、pH 示差法等。然而在測定時存在的問題有:花色苷易氧化，其標準品較難獲得;采用色價法、消光系數(shù)法測定時僅僅測得花色苷總量，而不能測得花色苷具體的單一組成成分;采用pH 示差法測定時多以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計，而事實上由試驗結果可知黑果枸杞中沒有矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，這樣計算結果必然造成很大誤差;有采用高效液相色譜法測定黑果枸杞中的花色苷組分含量的文獻報道，然而也只是測定了其中部分成分，并不全面。本文首先采用紫外-可見光譜法，通過一系列化學試驗并結合全波長掃描圖分析主要花色苷的結構，然后采用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析技術，無需對照品，在分離化合物的同時，在線提供每個花色苷類物質(zhì)的紫外光譜信息、相對分子質(zhì)量、分子結構碎片的質(zhì)譜信息，結合文獻資料分析花色苷的具體結構，可為黑果枸杞質(zhì)量控制提供了一定參考，為其資源的研究與開發(fā)利用提供了科學理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

黑果枸杞:采自青海諾木洪農(nóng)場，經(jīng)中國科學院西北高原生物研究所分析測試中心胡風祖教授鑒定確認為正品。樣品預處理:將收集的黑果枸杞陰干、粉碎，過40 目篩，裝入密封袋中密封，置干燥器中避光保存。

Delphinidin-3-O-glucoside(飛燕草素-3-O-葡萄糖苷)(H1401，上?；菡\生物科技有限公司);Peonidin-3-O-glucoside chloride(芍藥素-3-O-葡萄糖苷氯化物)(40796，Sigma);Malvin chloride(錦葵色素-3，5-二葡萄糖苷)(72815，Sigma);D-無水葡萄糖對照品(批號:110833-201205，中國藥品生物制品檢定所);鼠李糖對照品(批號:111683-200401，中國藥品生物制品檢定所)。濃鹽酸(甘肅白銀瑞斯物資貿(mào)易有限公司);無水乙醇、正丁醇、正丙醇、冰乙酸(天津市百世化工有限公司);氯化鋁、碳酸鋇(天津市光復精細化工研究所)，以上化學試劑為分析純。甲醇、乙腈(山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司，色譜純);實驗用水為一級超純水(18.25MΩ·cm)。

Varian Cary 300 Bio 紫外-可見分光光度儀(美國Varian 公司);Agilent 1100 Series LC/MSD Trap液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent 1100 DAD 檢測器(美國Agilent 公司);KQ-100E 型超聲波清洗器(昆山超聲儀器科技公司);AG135 電子天平(METTLER TOLEDO);RE-52AA 型旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 黑果枸杞花色苷的提取及紫外可見光譜初步分析

稱取已處理好的樣品粉末50 mg，精密稱定，置于50 mL 棕色容量瓶中，準確加入0.1%鹽酸-甲醇提取液25 mL，密塞并稱定重量，在40 ℃下避光超聲30 min。取出，冷卻至室溫，再次稱定重量，用提取液補足減失的重量，搖勻，過濾，一部分濾液用Varian Cary 300 Bio 紫外-可見分光光度儀進行全波長(200～800 nm)掃描，同時進行一系列化學鑒定試驗進行初步定性分析。

1.2.2 黑果枸杞花色苷預處理

按上述“1.2.1”項下內(nèi)容操作，剩余濾液減壓濃縮除去甲醇，所得浸膏加水懸浮后加入水飽和正丁醇萃取3 次，每次20 mL，合并萃取液，減壓濃縮除去正丁醇，取4 mL 濃縮液在9000 rpm 條件下離心5 min，取上清液經(jīng)0.45 μm 有機濾膜過濾，備用。

1.2.3 花色苷分離液相色譜條件

色譜柱:Spursil C18-EP 柱(250 × 4.6 mm，5 μm);流動相:A 相為乙腈;B 相為2%冰乙酸水溶液;梯度洗脫程序:0～10 min，10%～25%A;10～15 min，25%～29%A;15～35 min，29%～ 50%A;流速:0.7 mL/min;檢測波長:520 nm;柱溫:30 ℃;進樣量:10 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧電離源(ESI)，正離子方式檢測。采集參數(shù)如下:離子源溫度為425 ℃;碰撞氣為氬氣，流量為0.2 mL/min;霧化氣為氮氣，噴霧壓力為60 p.s.i;干燥氣為氮氣，溫度為350 ℃，流量為10.0 L/min;質(zhì)量掃描范圍(m/z)為100～1000;毛細管電壓為3500 V，電暈電流為4000 nA(Pos);源內(nèi)裂解電壓為1.00 Volt;掃描方式:Auto MS/MSn。

2 結果與分析

2.1 紫外-可見吸收光譜定性分析結果

2.1.1 0.1%鹽酸-甲醇溶液中色素顏色

常見的6 種花色苷在0.1%鹽酸-甲醇溶液中的顏色如下［11］:天竺葵色素(桔紅色)、矢車菊色素(淺紅色)、芍藥色素(深紅色)、飛燕草色素、牽牛花色素和錦葵色素(紫紅色)。試驗觀察到黑果枸杞花色苷在0.1%鹽酸-甲醇溶液中呈紫紅色，表明花色苷中的主要成分可能是飛燕草色素、牽?；ㄉ亍㈠\葵色素及其衍生物中的一種或幾種。

2.1.2 紫外-可見吸收光譜分析

通過花色苷在0.1%鹽酸-甲醇溶液中的紫外-可見光譜特性及添加試劑后光譜的變化可判斷花色苷的羥基、取代基、?；⑻擒真I的位置和數(shù)量。(1)花色苷的最大吸收波長特征吸收峰一個在可見光區(qū)540 nm 附近，另一個在紫外275 nm 附近。天竺葵色素λmax為510 nm 左右，矢車菊色素和芍藥色素λmax為530 nm 左右，飛燕草色素、牽?；ㄉ睾湾\葵色素λmax為540 nm 左右［11］。黑果枸杞花色苷在0.1%鹽酸-甲醇溶液中的紫外-可見吸收光譜圖(圖1)中最大吸收波長分別為545 nm 和294 nm，表明該色素主要是飛燕草色素、牽?；ㄉ亍㈠\葵色素及其衍生物中的一種或幾種;(2)向上述提取溶液中加入5% AlCl3甲醇溶液數(shù)滴后放置10 min，再次測定溶液的紫外-可見吸收光譜圖(圖1)，結果提取液對5% AlCl3甲醇溶液呈陰性反應，最大吸收波長從545 nm 略微移動到547 nm，Δλmax僅為2 nm，無明顯紅移現(xiàn)象，表明花色苷結構B 環(huán)上無鄰位酚羥基［12］，色素中主要含有天竺葵色素、芍藥色素、錦葵色素及其衍生物中的一種或幾種;(3)根據(jù)F.J.Francis 的結論［13，14］，即單一花色苷(3 號位置)在0.1%鹽酸-甲醇溶液中，其A440nm/Aλmax比值一般大于20;而雙取代的花色苷(3、5 號位置)在0.1%鹽酸-甲醇溶液中A440nm/Aλmax比值一般為十幾。試驗中A440nm=0.0652，A545nm=0.4533，A440nm/A545nm=14.38%＜20%，表明該色素是3，5 位均帶有糖苷鍵的雙取代花色苷;(4)根據(jù)花色苷在300～330 nm范圍內(nèi)有無吸收峰來判斷該色素分子是否含有酰基［15］。紫外-可見吸收光譜圖(圖1)顯示花色苷在304 nm 處有最大吸收峰，表明該色素分子內(nèi)含有?；?(5)糖組成的鑒定:將部分花色苷的0.1%鹽酸-甲醇提取液在避光40 ℃條件下減壓蒸餾除溶劑，殘留物經(jīng)80 ℃烘箱干燥除水分得黑果枸杞色素固體，粉碎后移入自封袋中置干燥器中備用。該色素粉末用2.0 mol/L 鹽酸溶液溶解并置沸水浴中水解1 h，加入飽和碳酸鋇溶液至水解液中沉淀，離心后上清液用于硅膠板點樣。于同一塊硅膠H 板點樣葡萄糖、鼠李糖和樣品水解液，以正丙醇∶水=4∶1(v/v)為展開劑展開，用聯(lián)苯胺試劑進行顯色，測量板上棕色色斑的Rf值。結果Rf(葡萄糖)=0.51，Rf(鼠李糖)=0.66，Rf(樣品)=0.51，可見黑果枸杞色素水解后生成了葡萄糖。

綜上所述，由試驗結果可初步推測出黑果枸杞色素中主要花色苷為?；腻\葵色素-3，5-二葡萄糖苷。

圖1 黑果枸杞0.1%鹽酸-甲醇提取液(A)及加入5%AlCl3甲醇溶液后提取液(B)的紫外吸收光譜圖(200～800 nm)Fig.1 UV absorption spectra of 0.1% hydrochloric acidmethanol extract of L.ruthenicum (A)and L.ruthenicum extract added with 5% AlCl3-methanol solution (B)(200～800 nm)

2.2 高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜結構確證結果

黑果枸杞中的花色苷成分復雜，并非單一成分，為進一步確證黑果枸杞色素提取液中具體花色苷結構，將部分提取溶液減壓濃縮除去甲醇，所得浸膏加水懸浮后用水飽和正丁醇萃取后再次減壓濃縮除去正丁醇后進行HPLC-ESI-MS/MS 分析(圖2)，通過各成分的色譜保留時間、紫外最大吸收波長并結合各成分質(zhì)譜的分子離子峰和碎片離子峰與參考文獻進行比對驗證，鑒定出8 種花色苷，數(shù)據(jù)見表1、質(zhì)譜圖及結構式見圖3-A～H。

具體結構分析如下:(1)峰1 在采用負離子模式進行全掃描時沒有響應，在正離子模式下有分子離子峰m/z 465.2，母離子峰m/z 303.2，并存在有碎片離子峰m/z 257.2，m/z 229.2 和m/z 153.1，與參考文獻［16］中的一級、二級特征離子質(zhì)譜數(shù)據(jù)一致，同時與飛燕草素-3-O-葡萄糖苷標準物質(zhì)在HPLC 的保留時間(RT)為12.90 min、DAD 譜圖特征λmax為525 nm 和HPLC-ESI-MS/MS 響應情況一致，由以上可確證峰1 是飛燕草素-3-O-葡萄糖苷;(2)峰2 參考了文獻［17］的色譜、質(zhì)譜數(shù)據(jù)，由母離子峰m/z 301.2 可確定其母核是芍藥素，圖中只有分子離子峰m/z 463.2，而無m/z 625.2(比分子離子峰m/z 463.2 多出162)，而162 是脫水六碳糖基的質(zhì)量數(shù)，可見該化合物是芍藥素的單糖取代物。紫外圖譜λ440nm處存在一個肩峰［18］，則說明C5-OH 未被取代。同時與芍藥素-3-O-葡萄糖苷氯化物標準物質(zhì)在HPLC 的保留時間(RT)為14.09 min、DAD譜圖特征λmax為516 nm 和HPLC-ESI-MS/MS 響應情況一致，由以上可確定峰是芍藥素-3-O-葡萄糖苷;(3)峰3 在采用負離子模式進行全掃描時沒有響應，在正離子模式下有分子離子峰m/z479.0，母離子峰m/z 317.2，同時還存在有碎片離子峰m/z 274.2 和m/z 245.3，與參考文獻［16］中化合物2 有一致的一級、二級特征離子質(zhì)譜數(shù)據(jù)，確定母核是矮牽牛素。其中，母離子是由分子離子失去一個質(zhì)量數(shù)為162 的中性碎片(即脫水六碳糖基)所得，根據(jù)上述“2.1.2”項下花色苷用鹽酸水解后的糖中只有葡萄糖，無其他的顯色斑點，可推斷出該化合物是矮牽牛素的單葡萄糖取代物。紫外圖譜λ440nm處無肩峰存在，則說明C5-OH 被取代，因此確定該化合物是矮牽牛素-5-O-葡萄糖苷;(4)a.峰4 的分子離子峰m/z 為933.4，其中有母離子峰m/z 479.3 和m/z 317.4，二者與峰3 的離子峰相同，說明峰4 與峰3存在相同的結構，其基本母核也是矮牽牛素。紫外圖譜λ440nm處無肩峰存在，說明結構5 位連有葡萄糖;b.碎片離子峰m/z 787.4 顯然是由分子離子峰失去一個質(zhì)量數(shù)為146 的中性碎片所得。而紫外圖譜λ310nm處有吸收峰，根據(jù)花色苷在300～330 nm 之間有無吸收峰可判斷該色素分子是否有酰基。如果有吸收峰，表明該色素有?；嬖?，在308～313 nm處有吸收表示?；乃釣閷ο愣顾幔粼?26～329 nm 有吸收則表示?；乃釣榭Х人幔?9］。在310 nm 處有吸收峰則說明該碎片離子是與對香豆酸脫水?；??；筚|(zhì)量數(shù)146)所得;c.碎片離子峰m/z 787.4 又與m/z 479.3 相差質(zhì)量數(shù)為308，這是與蕓香糖脫水縮合(縮合后質(zhì)量數(shù)308)而形成，由上述可知該化合物為矮牽牛素-3-O-(6-O-對香豆酰)蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷;(5)a.峰5 參考了文獻［17］中的色譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)由母離子峰m/z 331.1可確定其母核是錦葵色素;b.母離子峰m/z 655.2，m/z 493.2 和m/z 331.1，與參考文獻［20］中的特征離子質(zhì)譜數(shù)據(jù)一致，說明結構中存在有錦葵色素-3，5-二葡萄糖苷的結構;c.分子離子峰m/z 為843.1，它分別失去質(zhì)量數(shù)為42 和188 的中性碎片即得碎片離子峰m/z 801.1 和m/z 655.2，這是分別與乙酸(?；筚|(zhì)量數(shù)42)和對香豆酸(酰化后質(zhì)量數(shù)146)脫水縮合而形成的?；?，又根據(jù)空間位阻對位優(yōu)先?；蠡鶊F，同時結合a、b 兩點推斷出該化合物為錦葵色素-3-O-(6-O-對香豆酰-3-O-乙酰)-3，5-二葡萄糖苷;(6)峰6 同峰1 存在有母離子峰m/z 465.2 和m/z 303.2，并存在有碎片離子峰m/z 257.2，m/z 229.1 和m/z 153.2，可說明結構中有飛燕草素-3-O-葡萄糖苷的結構。母離子峰m/z 465.2 比分子離子峰m/z 為507.2 少了質(zhì)量數(shù)42，顯然這是與乙酸脫水縮合形成了乙?；?，同時考慮到空間位阻對位優(yōu)先酰化，推知該化合物為飛燕草素-3-O-(6-O-乙酰)葡萄糖苷;(7)a.峰7 同峰5 存在有母離子峰m/z 331.1，說明其母核是錦葵色素;b.母離子峰m/z 493.1 比m/z 655.1 少了162，這是脫水六碳糖基的質(zhì)量數(shù)，而紫外圖譜λ440nm處存在有肩峰，則說明C5-OH 未被取代，可見該化合物是錦葵色素的3為糖苷取代物;c.母離子峰m/z 655.1 由分子離子m/z 801.1 失去一個質(zhì)量數(shù)為146 的中性碎片(即脫水對香豆?；?所得。又根據(jù)空間位阻對位優(yōu)先?；纱_定該化合物為錦葵色素-3-O-(6-O-對香豆酰)葡萄糖苷;(8)峰8 中的分子離子峰m/z 655.2，母離子峰m/z 493.2 和m/z 331.1 以及λmax為525 nm 與參考文獻［20］中峰位12 物質(zhì)的特征離子質(zhì)譜數(shù)據(jù)和DAD 譜圖特征一致，同時與錦葵色素-3，5-二葡萄糖苷標準物質(zhì)在HPLC 的保留時間(RT)為25.42 min、DAD 譜圖特征λmax為525 nm 和HPLCESI-MS/MS 響應情況一致，由以上可確證峰8 是錦葵色素-3，5-二葡萄糖苷。

在正離子模式下，各組分在質(zhì)譜中的主要離子峰的質(zhì)荷比(m/z)見表1 和圖3。由試驗數(shù)據(jù)可知:(1)質(zhì)譜圖3-C～H 中均存在有質(zhì)荷比(m/z)比分子離子［M+H］+多出36.5 的離子峰，這應該與提取液中含有Cl-(由HCl 產(chǎn)生)離子有關，而Cl-離子一般是正價苯基苯并的抗衡陰離子，以平衡原正電荷使總體達到電中性，從而增加其穩(wěn)定性;(2)圖中存在有比母離子峰質(zhì)荷比(m/z)少18 和28 的離子峰，這是各組分離子峰繼續(xù)脫H2O 和脫CO 形成的;(3)在圖3-A～H 的中還可看到一些質(zhì)荷比最小的碎片離子峰依次如下:153.1、151.2、167.2、167.2、181.3、153.2、181.1、181.1。這些碎片離子峰的形成是由于在源內(nèi)CID 情況下花色苷C-環(huán)發(fā)生0/2位C-C 鍵斷裂而形成的0，2A+·自由基正離子。

圖2 黑果枸杞花色苷高效液相色譜圖Fig.2 HPLC-DAD chromatogram of anthocyanins in L.ruthenicum

表1 高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測黑果枸杞中花色苷結果Table 1 HPLC-ESI-MS/MS of anthocyanins in L.ruthenicum

2.3 黑果枸杞中花色苷的計算問題

以往在采用pH 示差法測定樣品中花色苷時，常以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計來計算樣品中花色苷的濃度，而由試驗結果可知黑果枸杞中并非含有矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，所以采用這種計算方法計算黑枸杞中花色苷的含量必然會引起結果誤差。由液相分析黑果枸杞中含有8 種花色苷，按面積歸一化法計算得最主要的花色苷是錦葵色素-3-O-(6-O-對香豆酰-3-O-乙酰)-5-O-二葡萄糖苷(68.35%)(表1)，并且錦葵色素的單糖苷、二糖苷取代物含量之和占總花色苷的77.93%。由此可知在按pH 示差法計算黑枸杞中花色苷含量時應代入錦葵色素單糖苷、二糖苷取代物的平均分子量及二者平均消光系數(shù)到計算公式中，結果更準確。

3 結論

本研究通過采用紫外-可見光譜法并結合高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜對黑果枸杞中花色苷組成及結構進行了鑒定。用0.1%鹽酸-甲醇溶液超聲提取黑果枸杞中的花色苷，取適量在紫外分光光度儀上全波長掃描進行初步光譜鑒定;再取適量減壓濃縮除去甲醇，所得浸膏加水懸浮后再用水飽和的正丁醇萃取，采用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜進行最終的結構確證。經(jīng)紫外分光光度法、質(zhì)譜和文獻報道綜合分析鑒定出黑果枸杞中含有8 種花色苷，分別是:飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、芍藥素-3-O-葡萄糖苷、矮牽牛素-5-O-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-(6-O-對香豆酰)蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷、錦葵色素-3-O-(6-O-對香豆酰-3-O-乙酰)-5-O-二葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-(6-O-乙酰)葡萄糖苷、錦葵色素-3-O-(6-O-對香豆酰)葡萄糖苷和錦葵色素-3，5-二葡萄糖苷?；ㄉ帐呛诠坭街兄匾慕M成成分，該試驗可為黑果枸杞的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

圖3 黑果枸杞中各花色苷質(zhì)譜圖(A～H 分別與圖2 中峰1～8 相對應)Fig.3 MS spectra of anthocyanins in L.ruthenicum (A to H was corresponding to peak 1-8 in Fig.2)

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