松杉暗孔菌發(fā)酵液的化學成分研究

郭 華，馮 濤，李正輝，劉吉開*

1鞍山師范學院化學與生命科學學院，鞍山 114005;2 中國科學院昆明植物研究所 植物化學與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室，昆明 650201

松杉暗孔菌(Phaeolus schweinitzii)，屬于多孔菌科(Polyporaceae)暗孔菌屬(Phaeolus)的一種木棲寄生高等真菌，菌蓋直徑一般在8～24 cm 之間，厚度約為2 cm。在我國主要分布于黑龍江、吉林、河北、新疆、四川、云南、廣東、臺灣等低中海拔的林區(qū)，可作藥用，煮后可食用，但生吃有毒［1］。文獻報道從該菌子實體中已分離得到具有β-分泌酶抑制活性的化合物hispidin［2］。為了進一步從松杉暗孔菌中尋找具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，我們對該菌發(fā)酵液進行了系統(tǒng)的化學成分研究，從其乙酸乙酯提取物中分離得到11 個已知化合物，其中1 為新的鏈狀化合物。

1 儀器與材料

比旋光度值由Horbia SEPA-300 旋光儀測定;UV 由UV-210A 型分光光度計測定;IR 由Bruker Tensor27 型紅外光譜儀測定(KBr 壓片);ESI+-MS由VG AutoSpec-3000 質(zhì)譜儀測定，高分辨質(zhì)譜HRTOF-MS 由API QSTAR 飛行時間質(zhì)譜儀測定;1H NMR 和13C NMR 由Bruker AM-400 和DRX 500 測定，內(nèi)標為TMS;柱層析硅膠(80～100 目和200～300 目)和薄層層析材料均為青島海洋化工廠生產(chǎn);分析型和制備型HPLC 為Agilent 1100 HPLC，色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm)和YMC(9.4 mm × 150 mm，5 μm)柱;Sephadex LH-20 為Amersham Biosciences 公司產(chǎn)品;RP-18(40～63 μm)為德國Merck 公司產(chǎn)品。顯色方法為254、365 nm 熒光，10%硫酸乙醇溶液和硫酸香草醛處理后加熱及碘蒸氣顯色。

松杉暗孔菌(Phaeolus schweinitzii)于2010年采自于昆明植物園，由中國科學院昆明植物研究所楊祝良研究員鑒定。

2 培養(yǎng)與發(fā)酵

由昆明植物研究所李正輝工程師采用斜面轉(zhuǎn)搖瓶液體培養(yǎng)的方法對該菌種進行發(fā)酵培養(yǎng)［3］。培養(yǎng)基:葡萄糖5%，豬肉蛋白胨0.15%，酵母粉0.5%，KH2PO4和MgSO4各0.05%，150 rpm，24 ℃搖床發(fā)酵25 d，發(fā)酵液總量為20 L。

3 提取與分離

松杉暗孔菌發(fā)酵液(20 L)除去菌絲體后，用乙酸乙酯萃取三次，提取液合并，減壓蒸干得浸膏10.0 g，上硅膠柱色譜粗分，石油醚-丙酮(100∶0→0∶100)梯度洗脫給出組分A～H。組分C(石油醚-丙酮，30∶1)先上正相硅膠柱，用石油醚-丙酮20∶1 分離，后經(jīng)RP-18 反相硅膠柱色譜，用甲醇-水(90%甲醇)系統(tǒng)洗脫，再用Sephadex LH-20(氯仿-甲醇，1∶1)柱層析，得到化合物3 (5.0 mg)、5 (8.5 mg)、8 (4.0 mg)、9 (3.0 mg)。組分E(石油醚-丙酮，10∶1)組分經(jīng)正相硅膠柱色譜，用石油醚-乙酸乙酯8∶1 溶劑系統(tǒng)分離，后用Sephadex LH-20(氯仿-甲醇，1∶1)柱層析，再經(jīng)制備型HPLC，用乙腈/水20∶80→50∶50 梯度洗脫，純化得到化合物1(3.0 mg)、2(5.5 mg)、7(6.5 mg)。組分F(石油醚-丙酮，5∶1)經(jīng)正相硅膠柱色譜，以氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)梯度洗脫(100∶1→20∶1)和Sephadex LH-20(氯仿-甲醇，1∶1)柱層析分離，再經(jīng)制備型HPLC，用乙腈/水40 ∶60梯度洗脫，純化得到化合物4(3.0 mg)、6(5.5 mg)、10(12.0 mg)、11(15.0 mg)。

4 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色粉末;［α］15D-9.8 (c 0.23，MeOH);UV (MeOH)λmax(log ε)270 (1.8)，231(1.7)nm;IR (KBr)νmax3436，2974，2939，1715 cm-1;1H NMR (CDCl3，400 MHz)及13C NMR(CDCl3，125 MHz)數(shù)據(jù)見表1;ESI-MS (positive)m/z 235［M+Na］+;HR-TOF-MS m/z 235.1314［M+Na］+(calcd for C12H20O3Na，235.1310)。

化合物1 的分子式由其HR-TOF-MS (m/z 235.1314［M+Na］+)確定為C12H20O3，有3 個不飽和度。其IR 譜在3436 cm-1與1715 cm-1處的吸收峰暗示該化合物的結(jié)構(gòu)中應(yīng)該含有羥基和雙鍵或羰基。在其13C NMR(DEPT)中，該化合物顯示1 個雙鍵，1 個含氧CH，2 個CO，2 個CH3和5 個CH2信號。由以上數(shù)據(jù)可認為化合物1 為鏈狀烯烴，同時包含兩個羰基和一個羥基，這些官能團的位置可由HMBC 譜確定:由H-1 (δH2.15，3H，s)與C-2 (δC208.0，s)、C-3 (δC42.9，t)和H-12 (δH1.06，3H，t，J=4.0 Hz)與C-11 (δC35.9，t)、C-10 (δC210.7，s)的HMBC 相關(guān)表明兩個羰基在2、10 位;由H-6(δH5.47，1H，dd，J=6.4，6.0 Hz)與C-7 (δC130.0，d)、C-8 (δC26.2，t)及C-9 (δC41.5，t)的HMBC 相關(guān)表明化合物1 為6-dodecene;另H-3 (δH2.53，2H，m)、H-6 和C-5 (δC71.8，d)的HMBC 相關(guān)說明C-5 位為羥基取代。此外，從H-6 的耦合常數(shù)(6.4，6.0 Hz)判定該化合物為順式烯烴，而C-5位的絕對構(gòu)型由于化合物量較少沒有確定。由此化合物1 被確定為(6Z)-5-hydroxy-6-dodecene-2，10-dione。

圖1 化合物1 的結(jié)構(gòu)和主要HMBC 相關(guān)Fig.1 Chemical structure and key HMBC correlations of 1

表1 化合物1 的1H and 13C 數(shù)據(jù)(400/125 MHz，CDCl3)Table 1 1H NMR and 13C NMR data of 1 at 400/125 MHz，respectively，in CDCl3

化合物2C11H12O2，黃色粉末;1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:6.64 (1H，d，J=8.5 Hz，H-8)，6.57 (1H，dd，J=8.5，2.9 Hz，H-7)，6.47(1H，d，J=2.9 Hz，H-5)，6.24 (1H，d，J=9.7 Hz，H-4)，5.62 (1H，d，J=9.7 Hz，H-3)，1.38(6H，s，2 ×CH3-2);13C NMR (CDCl3，150 MHz)δ:149.5 (s，C-6)，146.9 (s，C-8a)，132.2 (d，C-3)，122.3 (d，C-4)，122.0 (s，C-4a)，117.0 (d，C-8)，115.6 (d，C-7)，112.9 (d，C-5)，75.9 (s，C-2)，27.7 (q，2 ×CH3-2)。上述數(shù)據(jù)與文獻值［4］報道一致，確定該化合物為2，2-二甲基-1-苯并吡喃-6-醇。

化合物3 C18H32O2，無色油狀物;1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:5.35 (4H，m，H-9，H-10，H-12，H-13)，2.75 (2H，m，H-11)，2.34 (2H，t，J=7.6 Hz，H-2)，2.04 (4H，m，H-8，H-14)，1.63 (2H，m，H-3)，1.31 (14H，m，H-4 to H-7 and H-15 to H-17)，0.87 (3H，t，J=7.2 Hz，H-18)。上述數(shù)據(jù)與文獻值［5］報道一致，與亞油酸對照品共薄層，Rf值相同，確定該化合物為亞油酸。

化合物4 C10H10O4，無色油狀物;1H NMR(C5D5N，500 MHz)δ:7.79 (2H，m，H-3，H-6)，7.47(2H，m，H-4，H-5)，3.83 (6H，s，2 × OCH3);13C NMR (C5D5N，100 MHz)δ:168.1 (s，C-7，C-8)，132.6 (s，C-1，C-2)，131.6 (d，C-3，C-6)，129.3 (d，C-4，C-5)，52.6 (q，2 × OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻值［6］報道一致，確定該化合物為鄰苯二甲酸二甲酯。

化合物5 C28H44O，白色晶體;mp.152～154℃;EI-MS m/z (%):396［M］+(55)，363(61)，337(40)，271(17)，253(48)，211(37)，197(28)，185(23)，171(30)，157(55)，143(57)，131(27)，119(30)，91(28)，81(27)，69(100)，55(56);1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:5.56(1H，m，H-6)，5.41(1H，m，H-7)，5.12～5.28(2H，m，H-22，H-23)，3.59(1H，m，H-3)，1.02(3H，d，J=6.9 Hz，H-21)，0.94(3H，s，H-19)，0.91(3H，d，J=6.8 Hz，H-28)，0.83(3H，d，J=6.8 Hz，H-27)，0.81(3H，d，J=6.8Hz，H-26)，0.60(3H，s，H-18);13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:141.1(s，C-8)，139.6(s，C-5)，135.7(d，C-22)，132.2(d，C-23)，119.5(d，C-6)，116.2(d，C-7)，70.4(d，C-3)，56.0(d，C-17)，54.8(d，C-14)，46.2(d，C-9)，43.1(s，C-13)，40.7(d，C-24)，40.7(t，C-4)，40.6(d，C-20)，39.1(t，C-12)，38.5(t，C-1)，37.2(s，C-10)，33.2(d，C-25)，32.3(t，C-2)，28.2(t，C-16)，23.3(t，C-15)，21.1(t，C-11)，21.3(q，C-21)，19.8(q，C-26)，19.5(q，C-27)，17.4(q，C-28)，16.1(q，C-19)，11.9(q，C-18)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻［7］數(shù)據(jù)報道一致，確定該化合物為麥角甾-5，7，22-三烯-3β-醇。

化合物6 C12H12O2，無色油狀物;1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:6.89 (1H，dd，J=2.4，0.8 Hz，H-3)，6.77 (1H，dd，J=8.8，2.4 Hz，H-5)，6.74 (1H，dd，J=8.8，0.8 Hz，H-6)，5.41 (1H，m，H-4')，5.29 (1H，m，H-4')，3.83 (3H，s，OCH3)，1.94 (3H，dd，J=1.6，1.2 Hz，CH3-3');13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:154.5 (s，C-1)，149.2 (s，C-4)，126.9 (s，C-3')，122.1 (t，C-4')，120.1 (d，C-3)，116.5 (d，C-5)，113.3 (s，C-2)，112.4 (d，C-6)，94.9 (s，C-2')，84.3 (s，C-1')，56.7 (q，OCH3)，23.5 (q，CH3-3').上述數(shù)據(jù)與文獻值［8］報道一致，確定該化合物為Eulatinol。

化合物7 C8H10O2，無色結(jié)晶;EI-MS m/z(%):138［M］+(28)，107(100)，77(14);1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:6.94(2H，d，J=8.5 Hz，H-2，H-6)，6.66(2H，d，J=8.5 Hz，H-3，H-5)，3.61(2H，t，J=6.8 Hz，H-8)，2.63(2H，t，J=6.8 Hz，H-7);13C NMR (CDCl3，125 MHz)δ:154.8(s，C-4)，129.6(d，C-2，C-6)，129.4(s，C-1)，115.0(d，C-3，C-5)，64.2(t，C-8)，37.8(t，C-7)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻［9］報道一致，確定該化合物為對羥基苯乙醇。

化合物8 C11H10O2，無色油狀物;1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:6.82 (1H，dd，J=8.8，0.4 Hz，H-6)，6.81 (1H，d，J=3.2 Hz，H-3)，6.74(1H，dd，J=8.8，3.2 Hz，H-5)，5.43 (1H，m，H-4')，5.36 (1H，m，H-4')，2.01 (3H，dd，J=1.6，1.2 Hz，CH3-3');13C NMR (CDCl3，125 MHz)δ:150.9 (s，C-1)，148.7 (s，C-4)，126.1 (s，C-3')，123.1 (t，C-4')，117.6 (d，C-3)，117.5 (d，C-5)，115.5 (d，C-6)，109.9 (s，C-2)，97.6 (s，C-2')，81.9 (s，C-1')，23.5 (q，CH3-3')。上述數(shù)據(jù)與文獻值［8］報道一致，確定該化合物為Siccayne。

化合物9 C6H6O4，無色片晶;mp.174～175℃;1H NMR (CDCl3，500 MHz)δ:7.14 (1H，d，J=3.4 Hz，H-3)，6.45 (1H，d，J=3.4 Hz，H-4)，4.56(2H，s，CH2);13C NMR (CDCl3，125 MHz)δ:160.8(s，C-1)，159.7 (s，C-2)，144.6 (s，C-5)，118.6 (d，C-3)，109.2 (d，C-4)，56.5 (t，C-6)。上述數(shù)據(jù)與文獻值［10］報道一致，確定該化合物為5-羥甲基糠酸。

化合物10 C6H6O2，白色針晶;mp.170～171℃;1H NMR (CDCl3，500 MHz)δ:6.51 (4H，s，H-2，H-3，H-5，H-6)。上述數(shù)據(jù)與文獻值［11］報道一致，與對苯二酚對照品共薄層，Rf值相同，確定該化合物為對苯二酚。

化合物11 C6H6O3，黃色油狀物;EI-MS m/z(%):126［M］+(13)，125(13)，109(100)，97(27)，81(14)，69(6)，53(5);1H NMR (CDCl3，600 MHz)δ:9.56 (1H，s，H-1)，7.24 (1H，d，J=4.0 Hz，H-4)，6.53 (1H，d，J=4.0 Hz，H-3)，4.70 (2H，s，H-6);13C NMR (CDCl3，150 MHz)δ:178.0 (s，C-1)，160.7 (s，C-2)，152.6 (s，C-5)，122.6 (d，C-3)，109.5 (d，C-4)，57.5 (t，C-6)。上述數(shù)據(jù)與文獻值［12］報道一致，確定該化合物為5-羥甲基-糠醛。

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