以Hsp90 為靶點(diǎn)的4-(4-羥基-3-甲氧基苯亞甲基)姜黃素抗腫瘤活性研究

劉 洋，李 娜，吳麗賢，許建華

1福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)系，福州 350108;2福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科，福州 350001;3福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系;4 福建省天然藥物藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建醫(yī)科大學(xué)新藥研究所，福州 350108

熱休克蛋白90(Hsp90)是ATP 依賴的分子伴侶，能夠穩(wěn)定很多客戶蛋白，其中有腫瘤生長增值所必需的許多蛋白，例如Her2、BCR-ABL 和IKK 等。Hsp90 已成為重要的抗腫瘤靶點(diǎn)［1］。第一代天然Hsp90 抑制劑有格爾德霉素(GDA)，根赤殼菌素Radicicol(RD)及它們的衍生物。第二代合成Hsp90抑制劑主要是以嘌呤或間苯二酚為骨架的小分子化合物，有17 個(gè)已進(jìn)入臨床研究［2］。但由于有毒性大，生物利用度和水溶性差等缺點(diǎn)，至今沒有一個(gè)Hsp90 抑制劑被批準(zhǔn)上市。發(fā)現(xiàn)新化學(xué)骨架的Hsp90 抑制劑具有重要意義。

姜黃素(curcumin，Cur)為天然植物姜黃中的主要抗腫瘤活性成分。姜黃素能上調(diào)Hsp70［3］，下調(diào)Hsp90 客戶蛋白如BCL-ABL［4］，NF-κB，AKT，分解Hsp90 輔伴侶p23［5］。雖然姜黃素具有安全低毒廣譜的優(yōu)點(diǎn)，但由于其水溶性差、體內(nèi)代謝快、活性偏低和靶點(diǎn)過多等缺點(diǎn)影響其成藥性［6］。設(shè)計(jì)合成姜黃素衍生物，提高其選擇性、活性和成藥性，具有重要的理論和實(shí)際意義［7］。

姜黃素結(jié)構(gòu)為分子重復(fù)的同生型孿藥，4-羥基-3-甲氧基苯基和共扼β-二酮為其活性結(jié)構(gòu)。作者運(yùn)用拼合原理在Cur 4 位活潑亞甲基(圖1 中用虛線圈出)處引入活性藥效團(tuán)4-羥基-3-甲氧基苯亞甲基，使Cur 原有的共扼β-二酮與烯醇式互變的結(jié)構(gòu)固定為酮式，設(shè)計(jì)合成了4-(4-羥基-3-甲氧基苯亞甲基)姜黃素(C085，見圖1)，并于2008年先申報(bào)抗癌專利［8］。中山大學(xué)卜憲章等隨后報(bào)道C085 等4-芳亞甲基姜黃素衍生物為NF-κB 抑制劑［9］和乙二醛酶Ⅰ抑制劑［10］，國外印度Avadhesha Surolia 先報(bào)道過C085 有抗瘧活性［11］，后發(fā)現(xiàn)與微管蛋白也有很好的親合結(jié)合［12］。但目前姜黃素衍生物未有Hsp90 抑制活性報(bào)道。

本文先微波合成了C085，然后MTT 法考察C085 對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的抑制活性，Western Blot 法研究其對(duì)SKBr3 細(xì)胞中Hsp90 和客戶蛋白Her2、AKT 的影響。分子對(duì)接研究C085 與Hsp90 結(jié)合模式。

圖1 姜黃素和C085 的化學(xué)結(jié)構(gòu)與合成路線Fig.1 Chemical structures of curcumin and C085 and the synthetic route of C085

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

姜黃素、香草醛、哌啶和甲醇等溶劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。細(xì)胞株均購自中科院上海細(xì)胞庫，由福建醫(yī)科大學(xué)新藥研究所常規(guī)體外細(xì)胞傳代。Western Blot 中蛋白質(zhì)濃度測定用Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo Scientific，USA)，顯影劑為SuperSignal WestPico(Thermo Scientific，USA)。

1.2 儀器

熔點(diǎn)用上海精密儀器廠X-4 型顯微熔點(diǎn)儀測定，溫度未經(jīng)校正。核磁數(shù)據(jù)采用Bruker Avance Ⅲ型核磁共振儀(400 MHz)測定，TMS 為內(nèi)標(biāo)。質(zhì)譜采用Agilent 6410 Triple Quad LC/MS 測定。微波合成使用美國CEM 微波合成儀。美國BIO-RAD 公司全自動(dòng)酶標(biāo)儀。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 4-(4-羥基-3-甲氧基苯亞甲基)姜黃素(C085)的合成

10 mL 微波反應(yīng)管中依次加入姜黃素368 mg(1 mmol)，香草醛304 mg(2 mmol)，無水甲醇3 mL，哌啶30 μL，微波100 ℃下反應(yīng)30 min，濃縮移去溶劑，殘余物上硅膠柱分離純化，洗脫劑為乙酸乙酯∶石油醚=1∶3，得黃色粉末150 mg，收率33%，mp.96～98 ℃。

2.2 MTT 法檢測C085 對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用

選用9 株人腫瘤細(xì)胞:人乳腺癌細(xì)胞SKBr3、人慢性粒細(xì)胞白血病急變細(xì)胞株K562、人急性髓系白血病細(xì)胞株HL-60、人肝腫瘤細(xì)胞株HepG2、小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B-16、人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480、人胰腺癌細(xì)胞株Bxpc-3、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SHSY5Y、人胃癌細(xì)胞株MGC80-3。將細(xì)胞(10000 個(gè)/孔)接入96 孔培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的C085(DMSO 為空白對(duì)照)和姜黃素，對(duì)照組不加藥。另設(shè)空白組(只加培養(yǎng)基，無細(xì)胞)，每組設(shè)三個(gè)平行孔，37 ℃培養(yǎng)48 h，加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，離心棄上清，加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，充分裂解后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD 公司生產(chǎn))檢測570 nm處的吸光度(OD570)值。根據(jù)吸光度計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。

以同一藥物的不同濃度對(duì)腫瘤細(xì)胞生長抑制率作圖，可得到劑量反應(yīng)曲線，根據(jù)線性回歸方程求出該藥物的半數(shù)抑制濃度IC50，即細(xì)胞存活率減少50%時(shí)的藥物濃度。

2.3 C085 對(duì)Hsp90 客戶蛋白的降解作用

用C085(0.5、2.5、10 μM 三個(gè)濃度)，Cur(5、25、50 μM 三個(gè)濃度)處理人乳腺癌SKBr3 細(xì)胞24 h，0.5 μM 的GDA 作為陽性對(duì)照，等量的DMSO 作為陰性對(duì)照。吸去培養(yǎng)液，收集SKBR3 細(xì)胞，PBS漂洗1 次，加入NP-40 細(xì)胞裂解液，4 ℃裂解30 min，12000 rpm 離心15 min 取上清，測定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整蛋白濃度一致，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。再轉(zhuǎn)膜到PVDF 膜上。一抗室溫封閉2 h，TBST 洗滌3次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h，TBST 洗滌后用顯影劑顯影觀察。

2.4 分子對(duì)接模擬C085 與Hsp90 蛋白結(jié)合模式

C085 對(duì)接入Hsp90α 和NVP-AUY922 的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)(PDB 編碼:2VCI)。所有對(duì)接操作在SybylX1.3 藥物設(shè)計(jì)軟件中的surflex-dock 程序下按默認(rèn)值完成。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 C085 結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)

黃色粉末;mp.96～98 °C;1H NMR (CDCl3，400 MHz)δ:7.79 (s，1H)，7.74 (d，J=15.2 Hz，1H)，7.49 (d，J=16.4 Hz，1H)，7.16 (dd，J=8.4，2 Hz，1H)，7.09 (dd，J=8.1，2 Hz，1H)，7.04～7.02(m，3H)，6.99-6.96 (m，2H)，6.95 (d，J=15.4 Hz，1H)，6.91 (d，J=8.2 Hz，1H)，6.88 (d，J=8.2 Hz，1H)，6.86 (d，J=8.3 Hz，1H)，6.79 (d，J=16 Hz，1H)，5.93 (s，1H)，5.92 (s，1H)，5.88(s，1H)，3.92 (s，3H)，3.89 (s，3H)，3.83 (s，3H);13C NMR (CDCl3，100 MHz)δ:198.7，186.9，148.9，148.5，148.1，147.2，146.8，146.8，146.5，145.1，140.9，138.6，127.4，126.7，125.9，125.7，125.3，124.0，123.6，119.9，114.8，114.8，114.8，112.4，110.4，110.0，56.1，56.0，56.0;ESI-MS m/z［M-H］-501.1333。

3.2 C085 抗腫瘤活性測定結(jié)果

C085 對(duì)人乳腺癌細(xì)胞SKBr3、人慢性粒細(xì)胞白血病急變細(xì)胞株K562、人急性髓系白血病細(xì)胞株HL-60、人肝腫瘤細(xì)胞株HepG2、小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B-16、人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480、人胰腺癌細(xì)胞株Bxpc-3、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y、人胃癌細(xì)胞株MGC80-3 的IC50值依次為0.51、1.26、2.90、0.81、1.77、1.31、8.22、1.93、7.41 μmol/L(見表1)。C085 對(duì)上述各細(xì)胞株都表現(xiàn)出比母體藥物Cur 更強(qiáng)的細(xì)胞毒作用。特別是對(duì)SKBr3 和HepG2分別比姜黃素強(qiáng)36 倍和16 倍。以上結(jié)果表明C085 對(duì)體外腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用比其母體藥物Cur 的抑制作用明顯增強(qiáng)。

表1 C085 和姜黃素抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性Table 1 Cytotoxicity of C085 and Cur on tumor cell lines

3.3 C085 對(duì)Hsp90 客戶蛋白的降解作用

不同濃度的C085 處理SKBr3 細(xì)胞24 h 后，相關(guān)蛋白表達(dá)的Western blot 分析結(jié)果見圖2。圖2表明隨著C085 濃度的增加，Hsp90 的客戶蛋白Her2 和AKT 在24 h 的作用時(shí)間下，均呈現(xiàn)明顯降解趨勢，而Hsp90 的表達(dá)量基本不變，即C085 對(duì)Hsp90 的客戶蛋白有降解抑制作用。這一方式與陽性對(duì)照的Hsp90 抑制劑格爾德霉素(GDA，0.5μM)一致。

圖2 C085 對(duì)Hsp90 客戶蛋白的Western blot 分析結(jié)果Fig.2 Western blot analyses of SkBr3 cell lysates for Hsp90 client protein degradation.

3.4 分子對(duì)接模擬C085 與Hsp90 蛋白結(jié)合模式

C085 與Hsp90 蛋白結(jié)合模式圖見圖3。C085和Hsp90α 中的氨基酸殘基Ser50、ASN51、LYS58、Asp102、PHE138 形成5 個(gè)氫鍵，并且在ATP 結(jié)合口袋中C086(黃色分子)與NVP-AUY922(紅色分子)重疊得很好。

圖3 C085(黃色分子)對(duì)接模式圖和與NVP-AUY922(紅色分子)重疊Fig.3 A docking model of C085 (yellow)bound to the ATP binding site of human Hsp90α overlapped with NVPAUY922 (red)

4 討論

本論文通過體外MTT 法，Western bolt 方法和分子對(duì)接模擬，首次提出4-(4-羥基-3-甲氧基苯亞甲基)姜黃素(C085)很可能是Hsp90 抑制劑。Hsp90 抑制劑可分為N 端抑制劑，C 端抑制劑和影響Hsp90 與輔伴侶結(jié)合三類。C085 其具體作用方式還需用免疫共沉淀和FP 等方法進(jìn)一步研究。

1 Neckers L，Workman P.Hsp90 molecular chaperone inhibitors:are we there yet?Clin Cancer Res，2012，18:64-76.

2 Soga S，Akinaga S，Shiotsu Y.Hsp90 inhibitors as anti-cancer agents，from basic discoveries to clinical development.Curr Pharm Design，2013，19:366-376.

3 Angelo LS，Maxwell DS，Wu JY，et al.Binding partners for curcumin in human schwannoma cells:Biologic implications.Bioorg Med Chem，2013，21:932-939.

4 Wu LX(吳麗賢)，Xu JH(許建華)，Chen YZ(陳元仲)，et al.Down-regulation of P210bcr/abl by curcumin involves disrupting the molecular chaperone functions of Hsp90.Acta Pharm Sin (中國藥理學(xué)報(bào))，2006，27:694-699.

5 Lee JH，Chung IK.Curcumin inhibits nuclear localization of telomerase by dissociating the Hsp90 co-chaperone p23 from hTERT.Cancer Lett，2009，290:76-86.

6 Anand P，Kunnumakkara AB，Newman RA，et al.Bioavailability of curcumin:problems and promises Aggarwal.Mol Pharm，2007，4:807-818.

7 Esatbeyoglu T，Huebbe P，Erns IMI，et al.Curcumin--from molecule to biological function.Angew Chem Int Ed Engl，2012，52:5308-5332.

8 Xu JH(許建華)，Liu Y(劉洋)，Li Na(李娜)，et al.4-(4-羥基-3-甲氧基苯亞甲基)姜黃素及其制備方法和在制備抗癌藥物的應(yīng)用，專利號(hào)ZL200810071178.X，2008-06-05.

9 Qiu X，Du YH，Lou B，et al.Synthesis and identification of new 4-arylidene curcumin analogues as potential anticancer agents targeting nuclear factor-KB signaling pathway.J Med Chem，2010，53:8260-8273.

10 Yuan MG，Luo MX，Song Y，et al.Identification of curcumin derivatives as human glyoxalase I inhibitors:A combination of biological evaluation，molecular docking，3D-QSAR and molecular dynamics simulation studies.Bioorgan Med Chem，2011，19:1189-1196.

11 Mishra S，Karmodiya K，Surolia N.Synthesis and exploration of novel curcumin analogues as anti-malarial agents.Bioorgan Med Chem，2008，16:2894-2902.

12 Chakraborti S，Das L，Kapoor Neha.Curcumin recognizes an unique binding site of tubulin.J Med Chem，2011，54，6183-6196.