蛋白激酶R的原核表達(dá)、純化及多克隆抗體制備

張濤，羅維玉，姜水濤，朱鵬陽，李呈軍，

陳化蘭2，孫曉林1 ，姜麗2

( 1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州　730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)

生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部動物流感重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱　150001)

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蛋白激酶R的原核表達(dá)、純化及多克隆抗體制備

張濤1,2，羅維玉1,2，姜水濤2，朱鵬陽2，李呈軍2，

陳化蘭2，孫曉林1，姜麗2

( 1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)

生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部動物流感重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱150001)

摘要：【目的】 構(gòu)建蛋白激酶R的原核表達(dá)系統(tǒng)并制備其多克隆抗體.【方法】利用RT-PCR方法從人的A549細(xì)胞中擴(kuò)增蛋白激酶R(PKR)基因，將其克隆到表達(dá)載體pGEX-6P-1中，經(jīng)純化后制備特展異性多克隆抗體.【結(jié)果】 PKR基因經(jīng)測序鑒定后轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)終濃度0.5mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)GST-PKR融合蛋白，SDS-PAGE分析表明融合蛋白獲得穩(wěn)定表達(dá).表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Glutathione-sepharose 4B 親和層析初步純化后，用凝血酶切除GST標(biāo)簽，而后經(jīng)離子交換層析及分子篩在AKTA Explorer上進(jìn)一步純化，得到高純度無標(biāo)簽的PKR蛋白.以純化后的PKR蛋白為抗原免疫新西蘭白兔制備多克隆抗體，斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)檢測其效價(jià)達(dá)到1∶50 000以上，Western-blot和間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)表明制備的多抗與PKR蛋白的反應(yīng)具有高度特異性.【結(jié)論】 PKR蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)，且制備的多克隆抗體可用于PKR蛋白的檢測，從而為研究PKR在病毒感染過程中的作用提供了重要的工具.

關(guān)鍵詞：PKR；原核表達(dá)；蛋白純化；多克隆抗體

蛋白激酶R(protein kinase R，PKR)是對病毒感染等細(xì)胞內(nèi)壓力信號產(chǎn)生應(yīng)答的前哨絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由N-端的雙鏈RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dsRBD)和C-端的激酶結(jié)構(gòu)域組成.PKR廣泛存在于各類哺乳動物的組織和細(xì)胞中，其存在形式主要有無活性單體、無活性二聚體和活性二聚體.通常情況下，PKR是以無活性的單體形式存在，當(dāng)受到外因刺激后PKR從自我抑制的狀態(tài)中激活，形成有活性的二聚體[1-3].PKR在病毒感染后的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，其dsRBD能夠與病毒轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的及人工合成的dsRNA相互結(jié)合，從而使dsRBD從激酶區(qū)解離出來，導(dǎo)致激酶區(qū)活化和PKR被激活并行使抗病毒作用.PKR主要是通過磷酸化底物eIF-2，抑制病毒蛋白和宿主蛋白的翻譯從而發(fā)揮抗病毒效應(yīng)[4].另一方面，病毒在與宿主的斗爭過程中，可以利用自身編碼的蛋白抑制宿主的抗病毒作用.例如，流感病毒可以通過3種機(jī)制抑制PKR信號通路的激活:首先，PKR的表達(dá)可以被干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生，但流感病毒的NS1蛋白可以阻斷細(xì)胞內(nèi)的干擾素合成，從而降低細(xì)胞內(nèi)的PKR水平；其次，NS1蛋白可以扣押PKR激活的激活劑，即dsRNA，從而抑制PKR的激活；最后，NS1蛋白可以直接與PKR形成復(fù)合物，抑制PKR在dsRNA或激活因子PACT誘導(dǎo)下的激活反應(yīng)[5-6].研究發(fā)現(xiàn)，缺失NS1的流感病毒可以在PKR敲除的小鼠體內(nèi)復(fù)制，且其致病性有所增強(qiáng)[7].PKR除具有抗病毒功能外，在蛋白翻譯、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及腫瘤發(fā)生中也具有重要的作[8-10].

由上可知，作為一個(gè)重要的機(jī)體調(diào)控蛋白，PKR的結(jié)構(gòu)與功能研究顯得極為重要.目前已經(jīng)有PKR蛋白dsRBD、激酶結(jié)構(gòu)域以及激酶結(jié)構(gòu)域與eIF-2復(fù)合體的結(jié)構(gòu)解析報(bào)道[11].但是，鑒于PKR蛋白在宿主免疫系統(tǒng)中的重要作用，仍需深入研究PKR蛋白與其它宿主蛋白或病毒蛋白之間相互作用的分子機(jī)制和生物學(xué)功能.因此，本研究擬利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了PKR蛋白1-169位之間的區(qū)段，在進(jìn)行高效純化后免疫新西蘭白兔，制備其特異性的多克隆抗體[12-13]，以期為后續(xù)的PKR蛋白與其它宿主蛋白或病毒蛋白之間相互作用的結(jié)構(gòu)和功能研究提供條件.

1材料與方法

1.1細(xì)胞、載體與試驗(yàn)動物

人肺腺癌細(xì)胞(A549)、人胚胎腎細(xì)胞(293T)、pGEX-6P-1質(zhì)粒、凝血酶由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動物流感重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存.4月齡雌性新西蘭白兔購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心.

1.2菌株及主要試劑

DH5a、BL21(DE3)購自北京天根生化科技有限公司；Pfx高保真DNA聚合酶購自Invitrogen公司；BamHⅠ、NotⅠ、T4DNA連接酶購自NEB公司；DNA Marker 購自TaKaRa公司；Protein Marker購自Thermo Scientific公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司；DNA片段純化試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自AXYGEN公司；Glutathione-sepharose 4B親和層析柱填料購自GE Healthcare公司；弗氏佐劑、紅外標(biāo)記的羊抗兔IgG 和FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG等購自Sigma公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品.

1.3pGEX-6P-1-PKR重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

收集生長狀態(tài)良好的A549細(xì)胞，用TR-Iizol試劑提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)根據(jù)M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶說明書方法操作.根據(jù)GenBank上發(fā)表的人PKR的序列設(shè)計(jì)1對引物：P1：5′-GCATATGGATCCATGGCTGGTGATCTTTCAG-3′和 P2:5′-GCAAATGCGGCCGCCTATTCTTCTGATAATATCTGAAGATATGCAAG-3′，并引入BamHⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，用于擴(kuò)增PKR 蛋白1-169之間的區(qū)段.以cDNA為模板，P1、P2為上下游引物，用Pfx DNA聚合酶PCR擴(kuò)增目的片段.PKR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，68 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后68 ℃延伸10 min.擴(kuò)增結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將鑒定正確的PCR產(chǎn)物用DNA片段膠回收試劑盒回收純化.將回收的PKR片段和pGEX-6P-1載體分別用BamHⅠ和NotⅠ于37 ℃雙酶切處理，經(jīng)DNA片段純化試劑盒純化后用T4DNA連接酶于16 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有氨芐青霉素的LB平板，培養(yǎng)過夜后，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(Amp+)中，于37 ℃振蕩培養(yǎng)10 h后，進(jìn)行菌液PCR鑒定，鑒定陽性的菌液用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，利用本研究室的ABI3500xL序列測定儀測序鑒定為陽性的重組質(zhì)粒命名為pGEX-6P-1-PKR.

1.4GST-PKR融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將pGEX-6P-1-PKR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，挑取單菌落接種于25 mL LB液體培養(yǎng)基中(Amp+)，于37 ℃振蕩過夜培養(yǎng)，次日按1∶100比例接種于LB液體培養(yǎng)基(Amp+)，于37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)，待D600值達(dá)到0.6～0.8時(shí)降溫至23 ℃，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)劑，23 ℃誘導(dǎo)16～18 h后，4 000 r/min、4 ℃離心10 min收集菌體細(xì)胞，用預(yù)冷的Lysis Buffer緩沖液(25 mmol/L Tris 8.0,150 mmol/L NaCl,3 mmol/L DTT,0.5%Triton X-100)重懸菌體細(xì)胞，并加入終濃度1 mmol/L PMSF，高壓破碎后，16 000 r/min、4 ℃離心30 min分別收集上清與沉淀，SDS-PAGE分析GST-PKR融合蛋白的表達(dá)及可溶性情況，考馬斯亮藍(lán)染色.

1.5GST-PKR融合蛋白的純化

用預(yù)冷的Lysis Buffer緩沖液平衡Glutathione-sepharose 4B 親和層析柱，取高壓破碎離心后的上清液掛柱，再用Lysis Buffer 緩沖液沖洗雜蛋白，此步驟重復(fù)3次，最后用Glutathione-sepharose 4B 蛋白洗脫液(50 mmol/L Tris 8.0,3 mmol/L DTT,5 mmol/L Glutathione,reduced)洗脫，收集目的蛋白，加入凝血酶后于4 ℃作用過夜以切除GST-PKR融合蛋白的GST標(biāo)簽，經(jīng)SDS-PAGE分析切割情況，確認(rèn)切割完全后用AKTA explorer 純化系統(tǒng)進(jìn)行離子交換層析及分子篩分離純化，得到去除GST標(biāo)簽并具有高純度的PKR蛋白.

1.6PKR多克隆抗體的制備及抗體效價(jià)的測定

將純化的PKR蛋白與弗氏佐劑等量乳化后免疫4月齡雌性新西蘭白兔.初次免疫采用弗氏完全佐劑，免疫劑量為每只兔子200 μg蛋白，采取背部皮下多點(diǎn)注射的方法免疫.初次免疫后間隔14、28、42 d加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫時(shí)采用弗氏不完全佐劑，免疫劑量和方法同初次.第4次加強(qiáng)免疫3 d后耳緣靜脈采血，37 ℃靜置2 h，3 500 r/min離心10 min收集上清即為抗血清，用斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)檢測抗體效價(jià).

1.7Western-blot 鑒定

采用RT-PCR方法擴(kuò)增得到PKR全長基因(1 656 bp)，將目的片段克隆到真核表達(dá)載體pCAGGS中，測序鑒定得到pCAGGS-PKR重組質(zhì)粒.將pCAGGS-PKR重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中以過量表達(dá)PKR蛋白，轉(zhuǎn)染48 h后用RIPA裂解液(50 mmol/L Tris 7.5,150 mmol/L NaCl,0.5% NP40,1 mmol/L PMSF)裂解細(xì)胞，測定蛋白濃度，同時(shí)設(shè)置非轉(zhuǎn)染對照組以檢測細(xì)胞中的本底性PKR蛋白.取原核表達(dá)純化的GST-PKR融合蛋白(3 μg)、PKR蛋白(3 μg)、GST蛋白(3 μg)、過量表達(dá)PKR的293T細(xì)胞裂解液上清(含總蛋白80 μg)以及非轉(zhuǎn)染對照293T細(xì)胞裂解液上清(含總蛋白80 μg)樣品，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，以5%脫脂乳4 ℃封閉過夜，用PBST沖洗后以制備的PKR多克隆抗體為一抗(1∶1 000)，或以抗GST兔血清為對照(1∶1 000)，37 ℃室溫孵育1 h，洗滌后加入紅外標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗(1∶10 000)，37 ℃室溫孵育1 h，最后用紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描硝酸纖維素膜，檢測所制備的PKR多克隆抗體與目的蛋白反應(yīng)的特異性.

1.8間接免疫熒光(IFA)鑒定

將生長狀態(tài)良好的A549細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min，PBS浸洗3次，以0.05%Ttiton X-100室溫通透30 min，PBS浸洗3次，用5%BSA室溫封閉1 h后加入制備的多克隆抗體做為一抗(1∶1 000)，同時(shí)設(shè)免疫前兔血清作為陰性對照，4 ℃孵育過夜，PBS浸洗3次，加入FIFC標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，PBS浸洗3次，利用熒光顯微鏡進(jìn)行檢測，以鑒定所制備多克隆抗體的特異性.

2結(jié)果與分析

2.1pGEX-6P-1-PKR重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

通過RT-PCR方法擴(kuò)增獲得的PKR蛋白1-169位之間片段的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1-A所示，擴(kuò)增片段約為500 bp左右，與預(yù)期條帶大小一致.將酶切后的PKR片段克隆至原核表達(dá)載體pGEX-6P-1后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落培養(yǎng)并做菌液PCR鑒定，獲得500 bp左右的擴(kuò)增片段(圖1-B)，與預(yù)期結(jié)果一致.提取重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-PKR后，進(jìn)行測序分析，結(jié)果顯示目的基因插入正確，序列和讀碼框正確無誤.

M： DNA Maker DL 2000；1：A549細(xì)胞中PKR基因的RT-PCT擴(kuò)增產(chǎn)物；2：陰性對照；3：重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-PKR的菌液PCR產(chǎn)物；A：PKR基因的RT-PCR擴(kuò)增；B：重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-PKR的PCR鑒定.圖1　重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-PKR構(gòu)建Fig.1　The construction of recombinant plasmid pGEX-6P-1-PKR

2.2GST-PKR融合蛋白的表達(dá)及純化

將pGEX-6P-1-PKR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)，挑菌培養(yǎng)經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)16～18 h后收集菌體并高壓破碎后，進(jìn)行SDS-PAGE分析.如圖2所示，融合蛋白獲得高效表達(dá)，且具有可溶性，其分子質(zhì)量約為45kU，與預(yù)期大小一致.融合蛋白經(jīng)凝血酶切除GST標(biāo)簽后，利用AKTA explorer系統(tǒng)進(jìn)行離子交換層析及分子篩純化，收集目的蛋白峰，用氮?dú)鉂饪s裝置在低溫條件下濃縮，并測定蛋白濃度后置于液氮內(nèi)凍存?zhèn)溆?

M：預(yù)染蛋白Maker；1：含PGEX-6p-1-PKR質(zhì)粒的重組工程菌IPTG誘導(dǎo)后菌體裂解液；2：含PGEX-6p-1-PKR質(zhì)粒的重組工程菌高壓破碎離心后沉淀；3：含PGEX-6p-1-PKR質(zhì)粒的重組工程菌高壓破碎離心后上清掛柱后棄液；4：含PGEX-6p-1-PKR質(zhì)粒的重組工程菌高壓破碎離心后上清；5：純化的GST-PKR融合蛋白.圖2　GST-PKR融合蛋白的表達(dá)與純化Fig.2　Expression and purification of GST-PKR fusion protein

2.3PKR蛋白多克隆抗體效價(jià)檢測

以純化后的無標(biāo)簽PKR蛋白免疫4月齡新西蘭雌兔4次，每次間隔14 d，第4次免疫3 d后耳緣靜脈采血，采用斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)檢測抗體效價(jià)，其效價(jià)達(dá)到1∶50 000以上.

2.4PKR蛋白多克隆抗體的特異性檢測

將原核表達(dá)純化的GST-PKR融合蛋白、PKR蛋白、GST蛋白、過量表達(dá)PKR的293T細(xì)胞裂解液上清以及非轉(zhuǎn)染對照293T細(xì)胞裂解液上清樣品，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，分別以制備的PKR多克隆抗體或抗GST兔血清作為一抗進(jìn)行Western blot檢測，以確定所制備的PKR多克隆抗體與目的蛋白反應(yīng)的特異性.結(jié)果如圖3所示，當(dāng)以制備的PKR多克隆抗體為一抗時(shí)，純化的GST-PKR融合蛋白和純化的PKR蛋白樣品的轉(zhuǎn)印膜上均具有特異性的條帶，對照GST蛋白則無條帶，而且轉(zhuǎn)染PKR表達(dá)質(zhì)粒的293T細(xì)胞裂解液中的PKR蛋白含量也較非轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞對照組顯著增多；當(dāng)以抗GST兔血清作為一抗時(shí)，純化的GST-PKR融合蛋白和純化的GST蛋白對應(yīng)的轉(zhuǎn)印膜上具有特異性的條帶，而純化的PKR蛋白對應(yīng)的位置則無條帶.以上結(jié)果表明，PKR蛋白免疫制備的多克隆抗體與PKR蛋白的反應(yīng)具有特異性.

1：純化的GST-PKR融合蛋白；2：純化的PKR蛋白；3：純化的GST蛋白；4：轉(zhuǎn)染PKR表達(dá)質(zhì)粒的293T細(xì)胞裂解液； 5：非轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞裂解液對照；A：以制備的PKR多克隆抗體為一抗；B： 以抗GST兔血清為一抗.圖3　Western blot檢測兔抗PKR多克隆抗體的特異性Fig.3　Detection of the rabbit anti-PKR polyclonal antibody specificity by Western blot

2.5間接免疫熒光(IFA)鑒定

將生長良好的A549細(xì)胞固定封閉后，分別以制備的PKR多克隆抗體或免疫前兔血清作為陰性對照進(jìn)行IFA檢測.如圖4所示，本研究中制備的PKR多克隆抗體可以與細(xì)胞內(nèi)源性的PKR蛋白結(jié)合，產(chǎn)生特異性紅色熒光，而免疫前兔血清對照組則無紅色熒光信號(圖4).

A：以制備的PKR多克隆抗體為一抗；B： 以免疫前正常兔血清為一抗.圖4　IFA檢測A549細(xì)胞的PKR蛋白Fig.4　Detection of PKR in A549 cells by IFA

3討論

本實(shí)驗(yàn)室關(guān)注PKR蛋白所具有的廣譜抗病毒效應(yīng)，它可以抑制流感病毒、牛痘病毒、丙型肝炎病毒、巴爾病毒和單純皰疹病毒等.然而，這些病毒也逐漸進(jìn)化出復(fù)雜的機(jī)制去拮抗PKR的應(yīng)答反應(yīng)，并且該拮抗作用可以表現(xiàn)在PKR信號通路的每一個(gè)階段，包括抑制dsRNA激活因子的識別、阻斷PKR的激活、導(dǎo)致PKR降解以及阻止PKR底物磷酸化[14-15].但是，PKR蛋白和病毒之間的拮抗與反拮抗作用對病毒整個(gè)復(fù)制周期調(diào)控以及生物學(xué)特性的影響，仍有待于進(jìn)一步深入研究.對于PKR與其互作宿主因子或病毒蛋白的深入研究與探索，均需要對PKR蛋白的準(zhǔn)確鑒定與定位，這些都離不開識別PKR蛋白的高效特異性抗體的獲得.本研究中，作者選擇了能夠大量表達(dá)、穩(wěn)定性高且酶切純化效果好的，連接到帶有GST標(biāo)簽的pGEX-6P-1載體上PKR蛋白1-169位區(qū)段，GST-PKR融合蛋白在23 ℃低溫誘導(dǎo)16 h左右表達(dá)產(chǎn)量最高，菌體收集以及蛋白純化等步驟均在冰上或4 ℃條件下進(jìn)行，充分保證了蛋白的穩(wěn)定性及免疫原性.以分離純化的PKR蛋白為免疫原，制備了高效價(jià)、特異性強(qiáng)的多克隆抗體，為進(jìn)一步探究PKR蛋白及其相互作用蛋白的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ).

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(責(zé)任編輯李辛)

Prokaryotic expression,purification and polyclonal antibody preparation of protein kinase R

ZHANG Tao1,2,LUO Wei-yu1,2,JIANG Shui-tao2,ZHU Peng-yang2,LI Cheng-jun2,CHEN Hua-lan2,SUN Xiao-lin1,JIANG Li2

(1.College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Science,Harbin 150001,China)

Abstract：【Objective】 Establishing prokaryotic expression system and preparing polyclonal antibody preparation of protein kinase R (PKR).【Method】 Using the total RNA of human A549 cells as template,the protein kinase R (PKR) gene was amplified by RT-PCR and cloned into the expression vector pGEX-6p-1 and prepared as polyclonal antibody.【Result】 After sequencing validation of PKR,the recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21 (DE3) and were induced with 0.5 mmol/L IPTG into GST-PKR fusion protein.SDS-PAGE analysis showed that the GST-PKR fusion protein was stably expressed.The expression product was purified by glutathione-sepharose 4B affinity chromatography,treated by thrombin to remove the GST tag,further purified by ion-exchange chromatography and molecular sieve using the AKTA Explorer system.The purified PKR protein with high purity and no tag was then used to vaccinate New Zealand rabbits four times to prepare polyclonal antibody.Dot blot hybridization assay showed that the polyclonal antibody titer was more than 1∶50 000 in the rabbit antiserum.The specificity of the polyclonal antibody against PKR was then validated by western-blot and indirect immunofluorescence assay (IFA).【Conclusion】 PKR protein was successfully expressed in E.coli,and the polyclonal antibody could be used to detect PKR protein,thus providing a necessary tool for researching the role of PKR in the virus infection process.

Key words：protein kinase R；prokaryotic expression；protein purification；polyclonal antibody

通信作者：孫曉林，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楂F醫(yī)衛(wèi)生檢驗(yàn).E-mail：sunxl@gsau.edu.cn

基金項(xiàng)目：中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(03022014001)；國家自然基金青年基金(31402206).

收稿日期：2015-01-17；修回日期：2015-03-30

中圖分類號：Q 78

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1003-4315(2016)01-0007-06

第一作者：張濤(1989-)，男，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)公共衛(wèi)生檢驗(yàn)及動物流感分子生物學(xué)研究.E-mail：243484808@qq.com

姜麗，女，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯游锊≡⑸锱c分子生物學(xué).E-mail：jiangli@caas.cn