云南松樹皮低聚原花青素的提取工藝的優(yōu)化試驗

敖金成，張曉龍,，虞 泓，潘義宏，包崇彥

（1.云南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650091；2.云南瑞升煙草技術(shù)（集團）有限公司，云南 昆明 650106）

低聚原花青素（oligomeric procyanidins,OPC）是一種廣泛存在于植物中的一類多酚類活性物質(zhì)，是目前國際上公認的清除人體自由基最有效的天然抗氧化劑，具有較強的消除自由基能力和改善人體微環(huán)境的多重功能[1-2]，其抗氧化活性是維生素C（VC）的20倍，維生素E（VE）的50倍[3]。近年來，低聚原花青素在醫(yī)藥、保健品和化妝品領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。

云南松Pinus yunnanensisFranch是云南省主要的用材林樹種之一，為松科屬常綠針葉喬木。云南松具有較高的保健和藥用價值，隨著云南松樹脂、松花粉、松尖、球果等方面研究和利用的不斷深入，云南松的非木材資源價值日益得到體現(xiàn)[4-6]。秦永劍等[7-8]研究指出，云南松浸提物原花青素降解產(chǎn)物具有很強的自由基清除能力，且清除作用與樣品濃度存在量效關(guān)系。云南松資源豐富，每年均有大量作為木材被砍伐，樹皮大多采取丟棄或是燃燒的方式處置，造成資源的嚴(yán)重浪費，而南松樹皮中含有的原花青素市場應(yīng)用前景廣闊，需求量大，因此進一步優(yōu)化原花青素提取工藝研究顯得極為重要。以往對云南松化學(xué)成分提取研究相對較多[9-12]，關(guān)于云南松樹皮低聚原花青素提取工藝研究有一定報道[13-17]，但均存在提取效率低、能耗大等特點，難以實現(xiàn)有效開發(fā)，因此筆者以云南松樹皮為原料，研究不同溶劑、浸提時間、乙醇濃度、料液比等對原花青素浸提率的影響，通過正交試驗，綜合評價各種因子對其低聚原花青素浸提率的影響，旨在篩選出云南松樹皮低聚原花青素提取的最佳工藝組合，為云南松樹皮的綜合開發(fā)與應(yīng)用研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試材于2011年10月采自云南省楚雄州雙柏妥甸鎮(zhèn)中山村螞蝗菁山，地處101.582 787°E，24.756 737°N，海拔2 020 m，取樣云南松胸徑平均為（40±5） cm的樹木，取樣后帶回實驗室晾干，粉碎過20目篩備用。

主要試劑：乙醇、乙酸乙酯、濃硫酸、甲醇、丙酮、香草醛、（+）-兒茶素標(biāo)準(zhǔn)樣品（Sigma,Germany）。

1.2 主要儀器

FW-200型高效植物組織粉碎機（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；UV-2550型分光光度計（島津）。

1.3 樣品處理與測定

顯色劑（香蘭素）的配制：將300 mL濃硫酸緩慢加入到500 mL甲醇溶液中，并不斷攪拌，用甲醇溶液定容至1 L，配成30%硫酸溶液；準(zhǔn)確稱取10.0 g香草醛，溶解在甲醇中，定容至1 L，配制成1%的香草醛溶液。將上述30%的硫酸溶液與1%香草醛溶液1∶1混合，即為香蘭素顯色劑，該試劑不易保存，需現(xiàn)用現(xiàn)配。

吸光度測定：將過篩后的松樹皮用浸提液浸提后過濾，吸取適量濾液于小燒杯中，加入5 mL香蘭素顯色劑顯色，用甲醇溶液補至5.5 mL，充分混勻后避光靜置顯色10 min。顯色后于500 nm下測定樣品吸光度。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與原花青素浸提量計算

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將0.1 g（+）-兒茶素標(biāo)準(zhǔn)樣品用甲醇溶液定容至100 mL，配制成1 mg/mL的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取1 mg/mL兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、3、4、5、6、7于試管中，用甲醇溶液定容至10 mL，配制成濃度分別為 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL的兒茶素溶液，分別吸取上述溶液0.5 mL于試管中，加5 mL香蘭素顯色劑，充分混勻后避光靜置顯色10 min，空白不加浸提液，處理同上。以空白調(diào)零，于500 nm讀取各吸光值為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的各兒茶素含量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1）。

1.4.2 原花青素含量計算

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制Fig.1 Standard curve

原花青素含量=yv1/v2w。式中y為兒茶素含量（mg）；v1為顯色分取體積（mL）；v2為浸提劑體積（mL）；w為松樹皮質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗條件的篩選

2.1.1 檢測波長的篩選

由圖2可知，檢測波長呈正態(tài)分布，在波長為500 nm處吸光值最大，因此選作試驗檢測波長。

圖2 檢測波長篩選Fig. 2 Detection wavelength selection

2.1.2 試驗乙醇濃度初步篩選

在浸提時間、浸提劑體積及分取體積一定的條件下，分別以100%乙醇和50%乙醇為研究對象，初步篩選試驗乙醇濃度。根據(jù)低聚原花青素含量檢測結(jié)果（見表1），50%乙醇浸提效果較好，初步篩選出試驗浸提劑為50%乙醇。

2.2 乙醇濃度對云南松樹皮原花青素浸提率的影響

由表2可知，在浸提時間、浸提劑體積相同條件下，50%乙醇浸提劑對云南松樹皮低聚原花青素浸提效果最好，低聚原花青素含量關(guān)系依次表現(xiàn)為50%乙醇＞30%乙醇＞90%乙醇＞70%乙醇，50%乙醇浸提劑提取低聚原花青素含量分別是30%乙醇、90%乙醇、70%乙醇的1.07、1.10、1.08倍，所以確定50%乙醇作為最佳的乙醇浸提劑。

表1 試驗乙醇濃度初步篩選Table 1 Screened concentrations of alcohol tests

表2 乙醇濃度篩選試驗Table 2 Screening test of alcohol concentrations

2.3 浸提劑對云南松樹皮原花青素浸提率的影響

分別稱取5份（重量為和±0.1 g）云南松樹皮粉碎粉末于試管中，分別加入水、50%的甲醇、50%的乙醇、50%的丙酮、50%的乙酸乙酯各20 mL，各溶劑2次重復(fù)。在常溫下密閉浸提24 h，然后在分光光度計下檢測吸光度，求出原花青素浸提量。試驗結(jié)果表明，不同浸提劑對云南松樹皮中原花青素浸提量差異較大（見表3），各浸提劑對低聚原花青素含量影響關(guān)系依次表現(xiàn)為50%乙醇＞50%丙酮＞50%甲醇＞50%乙酸乙酯＞水。說明50%乙醇和50%丙酮溶劑對云南松樹皮低聚原花青素含量浸提效果最佳，水的浸提效果最差。由于丙酮溶劑容易將有異味的油脂類物質(zhì)一同浸提出，不易純化[14]，所以確定50%乙醇作為最佳浸提溶劑，研究結(jié)果與李鳳英和李春華[15]對葡萄籽中原花青素提取結(jié)論一致。

表3 浸提劑篩選試驗Table 3 Screening tests of extraction agents

2.4 浸提時間對云南松樹皮原花青素浸提率的影響

在浸提劑、浸提劑體積、分取體積一致的條件下，篩選浸提時間對云南松樹皮低聚原花青素含量的影響。結(jié)果表明，浸提時間對低聚原花青素含量的影響差異不大（見表4），以浸提時間56 h組含量最高，浸提時間24 h組含量次之，含量最高與次之的僅相差0.118 mg/g，說明隨提取時間的增加，細胞內(nèi)外濃度已達到平衡，其提取率已不明顯，故確定浸提時間以24 h為宜。

2.5 浸提劑體積對原花青素含量的影響

由表5可知，其他條件一致時，低聚原花青素的浸出率隨浸提劑體積的增加表現(xiàn)出先上升后降低的趨勢。當(dāng)浸提劑體積為14 mL時，原花青素的浸出率最高，考慮后續(xù)工藝中的濃縮過程，浸提劑體積越高，濃縮時間越長，能耗越高，因此確定浸提劑體積以14 mL為宜。

表4 浸提時間篩選試驗Table 4 Screening tests of extraction time

表5 浸提劑體積篩選試驗Table 5 Screening tests of extraction agent volume

2.6 正交試驗

為研究不同提取條件對云南松樹皮低聚原花青素浸提率的綜合影響，達到減少成本，降低能耗的目的。在上述單因素試驗的基礎(chǔ)上，重點考慮浸提時間、乙醇濃度及料液比因素進行正交試驗設(shè)計，具體因素及水平見表6，試驗結(jié)果及分析見表7。正交試驗固定提取1次。

表6 正交試驗設(shè)計Table 6 Orthogonal experimental design

表7 正交試驗結(jié)果及分析Table 7 Orthogonal test results and analysis

從表7正交試驗結(jié)果可以看出，影響云南松樹皮低聚原花青素提取率的因素順序分別為A（浸提時間）＞B（乙醇濃度）＞C（料液比），最優(yōu)因素水平組合為浸提時間24 h、浸提劑60%乙醇、料液比1∶8。

3 結(jié) 論

該研究在單因素檢測分析基礎(chǔ)上，通過正交試驗設(shè)計，同時考慮浸提時間、浸提劑、料液比組合對云南松樹皮低聚原花青素提取率的影響，表明影響云南松樹低聚皮原花青素提取率的因素順序分別為A（浸提時間）＞B（乙醇濃度）＞C（料液比），以浸提時間24 h，浸提劑60%乙醇和料液比1∶8組合對云南松樹皮低聚原花青素提取率的影響最大，優(yōu)選得到的工藝穩(wěn)定、提取效率高，因而可確定為云南松樹皮低聚原花青素提取的最佳工藝組合。

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