乙型肝炎病毒X蛋白升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子機(jī)制研究＊

王 君， 何生松， 劉亞男， 張 盼， 姚景宏

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院感染科，武漢430022

原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌（HCC）是最常見的原發(fā)惡性腫瘤之一，死亡率極高，其中乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染是其主要致病因素［1－3］。在 HBV引發(fā)的HCC中，HBV的病毒表達(dá)產(chǎn)物乙型肝炎病毒x（HBx）蛋白起著重要的作用［4］。HBx蛋白作為細(xì)胞的反式激活因子可以調(diào)節(jié)很多細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)Ca2＋離子濃度，其與細(xì)胞的增殖有關(guān)［5－6］。肝細(xì)胞作為非興奮性細(xì)胞，不表達(dá)電壓依從性鈣通道（voltageoperated calcium channels，VOCs），Ca2＋通透性受體調(diào)節(jié)通道（ROCs）和通透性鈣池調(diào)節(jié)離子通道（SOCs）是調(diào)控其細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度［Ca2＋］i的主要通道?，F(xiàn)已證實(shí)，SOCs在維持由激素誘導(dǎo)的原代肝細(xì)胞鈣振蕩中發(fā)揮重要作用［7］。目前認(rèn)為 ROCs引起的［Ca2＋］i升高是一個(gè)瞬時(shí)變化，不足以維持細(xì)胞的長期反應(yīng)，SOCs則可持續(xù)升高［Ca2＋］i，而［Ca2＋］i持續(xù)升高是胞內(nèi)多種激酶激活的必要條件［8］。SOCs被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔Ca2＋濃度降低激活而開放，生理作用在于補(bǔ)充內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2＋而避免鈣庫Ca2＋耗竭。間質(zhì)相互作用因子1（stromal interaction molecule 1，STIM1）及鈣釋放激活鈣通道蛋白1（calcium release－activated calcium channel protein 1，Orial）是目前已確定的肝細(xì)胞SOCs組成蛋白［9］，STIM1為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2＋濃度感受器，Orail是SOCs在細(xì)胞膜上的孔蛋白。目前HBx蛋白如何調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子機(jī)制不清，本研究從HBx蛋白與SOCs相關(guān)蛋白著手，探討HBx蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的具體機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料

HEK293（ATCC中心，Manassas，USA）；攜帶HBx全 長 基 因 的 pcDNA－Flag－HBx 質(zhì) 粒、攜 帶Orai1全長基因的pcDNA－HA－Orai1質(zhì)粒、攜帶STIM1全長基因的pcDNA－HA－STIM1質(zhì)粒（從NIH神經(jīng)實(shí)驗(yàn)室Prof．Lutz Birnbaumer處獲得）；Fura－2／AM、Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）；細(xì)胞培養(yǎng)液 DMEM、HBSS、PBS、胎牛血清、BSA（Gibco公司）；蛋白質(zhì) Marker（晶美生物有限公司）；胰蛋白酶、鼠單克隆HBx抗體、鼠單克隆HA抗體、鼠單克隆myc抗體、羊抗鼠多克隆抗體（Sigma公司）；ECL顯色試劑盒（默克公司）；毒胡蘿卜素（thapsigargin，Calbiochem公司）；谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶瓊脂糖珠 （GST－Beads，Amersham Biosciences公司）；倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1．2 方法

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng) HEK293細(xì)胞用含10%胎牛血清和1% 青霉素－鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，待細(xì)胞貼壁生長達(dá)80%～90%融合度時(shí)，預(yù)熱的PBS清洗細(xì)胞；預(yù)熱的胰蛋白酶消化細(xì)胞，加3mL DMEM 培養(yǎng)液（含10%FBS）以終止消化反應(yīng)，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入10 mL離心管中；1 000r／min，離心5min，去除上清；加入10mL DMEM 培養(yǎng)液（含10%FBS），重新懸浮細(xì)胞，使細(xì)胞充分打散；進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，將適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至6孔培養(yǎng)板中（細(xì)胞密度6×104個(gè)／mL）；置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1．2．2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 當(dāng)細(xì)胞生長狀態(tài)良好且貼壁細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；在Lipofectamine 2000介導(dǎo)下，將pcDNA－Flag－HBx、pcDNA－HA－Orai1、pcDNA－HA－STIM1及空載質(zhì)粒各2．5μg轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱孵育5h后去除含脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)液，加入2mL含10%血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。

1．2．3 co－IP實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48h后，吸走培養(yǎng)孔中培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液（含cocktail蛋白酶抑制劑）1mL，細(xì)胞刮收集細(xì)胞；超聲裂解細(xì)胞；4℃，8 000r／min，離心15min，取上清。取30μL含有Flag蛋白的瓊脂糖珠（Flag－beeds）或 HA 蛋白的瓊脂糖珠（HA－beeds），用預(yù)冷的 RIPA 緩沖液洗3遍，12 000r／min，離心1min，并用RIPA緩沖液配制成1∶1瓊脂糖珠懸浮液。將瓊脂糖珠懸浮液加入到已收集的細(xì)胞裂解液中，4℃層析柜旋轉(zhuǎn)孵育4h。在4°C，以12 000r／min，離心3min，將瓊脂糖珠懸浮液離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠懸浮液用預(yù)冷的RIPA緩沖液洗3遍，800μL／遍；最后加入35μL 2×SDS上樣緩沖液，將上樣樣品水浴95℃，5min，蛋白變性。取適量表達(dá)蛋白樣品上樣后，用10%的SDS－PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)印于PVDF膜上，用含5%的脫脂奶粉TBST室溫封閉蛋白印跡膜l h，加入一抗即鼠單克隆HA抗體或Flag抗體，4℃孵育過夜。用TBST振搖洗滌3次，10min／次，加入二抗即羊抗鼠IgG，室溫孵育2h，接著用TBST振搖洗滌3次，10min／次，用ECL顯色，暗室膠片曝光顯影。

1．2．4 GST pull－down實(shí)驗(yàn) 將編碼蛋白 Orai1及Orai1C末端（257～301aa）與GST的重組質(zhì)粒GST－Orai1及GST－CT轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）菌株（本實(shí)驗(yàn)室已制備）。分別挑取單個(gè)克隆到含有5mL LB（＋100μg／mL Amp）的10mL細(xì)菌培養(yǎng)管中，37℃培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)移到含有500mL LB（＋100μg／mL Amp）的1L錐形瓶中，37℃，225r／min培養(yǎng)至A600達(dá)0．6～0．8左右，加入終濃度1 mmol／L的IPTG，30℃，225r／min誘導(dǎo)3h；8 000 r／min，5min 4℃離心收集細(xì)菌，去盡上清，置于冰上，每500mL培養(yǎng)液加入10mL細(xì)菌裂解液（PBS＋1%Triton－100＋PMSF），吹打混勻。冰上超聲破碎，開4s，停6s，總30min，至裂解液充分清亮。4℃，12 000r／min，離心15min，取上清，－80℃保存?zhèn)溆谩cDNA－myc－HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，提取目的蛋白。同時(shí)分別取500μL融合蛋白GST－Orai1及GST－CT冰上凍融；分別取2管 GST－Beads（Immobilized Glutathione）到EP管中，50μL／管，用800μL PBS＋1%Triton－100潤洗3次，分別將凍融融合蛋白GST－Orai1及GST－CT與之混勻，4℃層析柜旋轉(zhuǎn)結(jié)合1h。PBS＋1%Triton－100洗3次；用10%BSA封閉30min，再用PBS＋1%Triton－100洗2次。取50μL已純化myc－HBx蛋白裂解液，加入50μL 2×SDS上樣緩沖液，水浴95℃，5min，蛋白變性。其余myc－HBx蛋白裂解液樣品加入到預(yù)處理過的GST－Beads的EP管中，4℃層析柜旋轉(zhuǎn)結(jié)合3h；用PBS＋1%Triton－100洗3次。用30μL 2×SDS上樣緩沖液溶解beads上的蛋白，水浴55℃，10min，蛋白變性。高速離心，取適量表達(dá)蛋白樣品上樣后，用12%的SDS－PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)印于PVDF膜上，用含5%的脫脂奶粉TBST室溫封閉蛋白印跡膜l h，加入一抗即鼠單克隆myc抗體，4℃孵育過夜，用TBST振搖洗滌3次，10min／次，加入二抗即羊抗鼠IgG，室溫孵育2h，接著用TBST振搖洗滌3次，10min／次，用ECL顯色，暗室膠片曝光顯影。

1．2．5 細(xì)胞內(nèi)鈣離子檢測(cè) 取已預(yù)先放入細(xì)胞爬片的6孔板，接種HEK293細(xì)胞懸液2mL（細(xì)胞密度6×104個(gè)／mL），置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長達(dá)80%時(shí)，分別用pcDNAGFP－HBx，pcDNA－HA－Orai1，pcDNA－GFP－EV，pcDNA－HA－STIM1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h后，吸走培養(yǎng)液，用PBS輕柔地洗滌1次，加入含2μmol／L Fura－2／AM 的細(xì)胞培養(yǎng)液1mL，37℃避光孵育25min，讓熒光染料充分進(jìn)入細(xì)胞；隨后取出細(xì)胞爬片，固定在灌流槽上，室溫下，用無鈣HBSS洗3次；將灌流槽放置在鈣離子測(cè)量／成像系統(tǒng)的倒置顯微鏡載物臺(tái)上，分別用波長為340nm和380nm的單色光去激發(fā)染色后的細(xì)胞使之發(fā)出熒光，選擇細(xì)胞區(qū)域后，每次選擇25～30個(gè)細(xì)胞，用電荷耦合器件（CCD）采集熒光強(qiáng)度和熒光圖像，F(xiàn)340／F380熒光比值代表細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度變化。起始用微量進(jìn)樣器小心加入含有EGTA的HBSS，觀察它對(duì)所測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的影響；200s后，加入含有2μmol／L毒胡蘿卜素的HBSS，使鈣庫鈣離子耗竭；然后加入含2mmol／L Ca2＋的 HBSS，誘導(dǎo)鈣池操控的鈣內(nèi)流（SOCE）。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 12．0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，測(cè)定結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組數(shù)據(jù)間均數(shù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)良好，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞狀態(tài)良好，使用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染率為30%～40%（圖1）。

2．2 co－IP實(shí)驗(yàn)

結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)HA標(biāo)記的Orai1蛋白可以與Flag標(biāo)記的HBx蛋白免疫共沉淀，而對(duì)照組不發(fā)生免疫共沉淀（圖2）。表明HBx蛋白可以與細(xì)胞膜鈣離子通道Oria1蛋白結(jié)合，產(chǎn)生相互作用。

圖1 激光共聚焦顯微鏡觀察HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況Fig．1 Laser confocal microscopy of transfection of HBx gene into HEK293cells

圖2 co－IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在細(xì)胞內(nèi)HBx蛋白與Orai1蛋白結(jié)合情況Fig．2 co－IP assay demonstrating the intracellular interation between HBx protein and Orai1

2．3 GST pull－down實(shí)驗(yàn)

為進(jìn)一步確定HBx蛋白與細(xì)胞膜鈣離子通道Oria1結(jié)合蛋白相互作用的具體部位，收集蛋白進(jìn)行 GST pull－down實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示 Orai1－CT 末端（257～301aa）可以特異性地和 HBx蛋白結(jié)合，Orai1－NT（1～71aa）末端及 Orai1－loop結(jié)構(gòu)域（141～173aa）不與HBx蛋白結(jié)合，對(duì)照組無結(jié)合，見圖3。

圖3 GST pull－down實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HBx蛋白與Orai1蛋白相互作用部位Fig．3 GST pull－down assay of the interacting domain between Orai1and HBx proteins

2．4 細(xì)胞內(nèi)鈣離子檢測(cè)

為明確HBx蛋白與Orai1結(jié)合后對(duì)SOCE影響，共轉(zhuǎn)染 pcDNA－GFP－HBx，pcDNA－HA－Orai1，pcDNA－GFP－EV，pcDNA－HA－STIM1 質(zhì) 粒 到HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞加入熒光探針Fura－2／AM后使用毒胡蘿卜素耗竭存儲(chǔ)在細(xì)胞內(nèi)的鈣離子，然后加入Ca2＋，誘導(dǎo)SOCE。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染HBx的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的對(duì)照組相比較，F(xiàn)ura－2／AM 熒光比率 F340／F380高于對(duì)照組，表明HBx可增加細(xì)胞鈣內(nèi)流，轉(zhuǎn)染 HBx＋Orai1＋STIM1的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染Orai1＋STIM1或者HBx的細(xì)胞相比F340／F380比率增高更明顯，細(xì)胞鈣內(nèi)流更加明顯（圖4），SOCE產(chǎn)生后，在700s時(shí)間點(diǎn)左右，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度最高，表達(dá)HBx＋ Orai1＋STIM1的細(xì)胞與Orai1＋STIM1過表達(dá)的細(xì)胞相比較，可顯著增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度（P＜0．01）。

圖4 細(xì)胞內(nèi)鈣離子檢測(cè)證實(shí)HBx蛋白可增加細(xì)胞鈣內(nèi)流Fig．4 Single－cell calcium measurement revealed that HBx protein could increase the intracellular calcium

3 討論

HBV感染在我國是HCC的最主要致病原因，絕大部分HCC患者合并有HBV感染［2］。HBx基因編碼的HBx蛋白具有強(qiáng)大的惡性轉(zhuǎn)化能力，可以誘導(dǎo)HCC的發(fā)生，并增加其惡性表型，導(dǎo)致腫瘤的預(yù)后不良［10－11］。我們注意到，HBx無論是在促進(jìn)HBV復(fù)制，還是在誘導(dǎo)肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，常需要首先激活鈣離子信號(hào)，引起細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)失穩(wěn)。已研究證實(shí)，HBx通過升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度激活PyK2和FAK激酶是 HBV復(fù)制的必要條件［6，12］。HBx在升高［Ca2＋］i同時(shí)激活細(xì)胞JNK和 MAPK信號(hào)途徑，并促進(jìn)細(xì)胞增殖［13］。因此，鈣信號(hào)在HBx發(fā)揮功能中起重要作用。

鈣離子是重要的細(xì)胞內(nèi)第二信使，參與細(xì)胞的多種生理病理過程［14］。肝細(xì)胞在生理濃度的激素作用下可引起［Ca2＋］i持續(xù)升高或振蕩［7］，在生理狀態(tài)下，鈣離子信號(hào)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的多種生理功能。［Ca2＋］i升高需要細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，SOCs是肝細(xì)胞等非興奮性細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的主要通道［15－16］。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣池中的鈣離子釋放后，既可激活細(xì)胞膜上的SOCs，引起鈣內(nèi)流。胞膜蛋白Orai1和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白STIM1是與SOCs密切相關(guān)的蛋白，其中Orai1蛋白是33kD的膜蛋白，又稱為CRACM1（calcium－release－activated calcium modulator 1）?；蚯贸齇rai1能顯著降低細(xì)胞鈣池操控的鈣離子內(nèi)流（SOCE）或鈣離子釋放激活的鈣電流（ICRAC）［17］。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的Ca2＋釋放后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的STIM1與胞膜上的Orai1相互作用，形成四聚體，在胞膜上形成高選擇性孔道引起鈣內(nèi)流，即SOCE或ICRAC［18］。Orai1激活引起的鈣內(nèi)流持續(xù)時(shí)間長，振幅大，可激活轉(zhuǎn)錄因子AP－1、CREB及NFAT等參與細(xì)胞活化、增殖、遷移等。

目前關(guān)于HBx蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡的機(jī)制有線粒體方面的報(bào)道，Gearhart等［19］研究發(fā)現(xiàn)HBx通過開放或者關(guān)閉線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）而增加細(xì)胞內(nèi)的鈣內(nèi)流。但是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的鈣離子存儲(chǔ)庫，目前還無HBx蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及鈣離子關(guān)系的報(bào)道，本研究采用co－IP實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞內(nèi)研究HBx蛋白與SOCs相關(guān)蛋白的關(guān)系，結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)HBx蛋白可以與Orai1蛋白相互作用。使用GST pull－down實(shí)驗(yàn)明確HBx蛋白與Orai1蛋白結(jié)合的具體部位，結(jié)果顯示HBx蛋白可以與Orai1的C末端（257～301aa）結(jié)合，進(jìn)一步確定了HBx蛋白與Orai1蛋白作用的具體部位。細(xì)胞內(nèi)鈣離子檢測(cè)結(jié)果顯示Orai1＋STIM1＋HBx過表達(dá)細(xì)胞，鈣離子增加最明顯，證實(shí)HBx蛋白通過與Orai1蛋白結(jié)合從而增加細(xì)胞內(nèi)鈣內(nèi)流，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子被耗竭時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Orai1過表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)鈣內(nèi)流增加更加明顯。因此，我們可以推測(cè)，HBx蛋白可以通過與Orai1蛋白的C末端結(jié)合，擾亂細(xì)胞內(nèi)［Ca2＋］i的穩(wěn)態(tài)，影響其細(xì)胞周期，導(dǎo)致肝細(xì)胞異常增殖，可能參與肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程。此研究與前期研究結(jié)果有所不同，Gearhart等［19］是從線粒體方面揭示HBx蛋白干擾細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡機(jī)制，而本研究從SOCs相關(guān)蛋白著手，探討HBx蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡具體機(jī)制，從分子水平揭示HBV感染導(dǎo)致HCC的機(jī)制，該研究結(jié)果將為HCC的防治提供理論基礎(chǔ)。本研究針對(duì)HBx蛋白的功能，探討其誘發(fā)肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的新機(jī)制，為開展肝癌的防治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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