宮頸癌宮頸活檢組織DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化的臨床意義

[摘要] 目的 研究宮頸活檢組織DAPK1基因甲基化在宮頸癌中的臨床意義。 方法 采用甲基化特異性PCR檢測(cè)宮頸癌患者和正常女性宮頸活檢組織DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化，比較其差異并分析宮頸癌患者宮頸活檢組織DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化與臨床病理因素的關(guān)系。 結(jié)果 宮頸癌患者宮頸活檢組織DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化率顯著高于正常女性（P < 0.05）。宮頸癌患者宮頸活檢組織DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化率在年齡、吸煙史、酗酒史和病理類型無明顯差異（P > 0.05），在HPV感染、分化程度、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和Figo分期中的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 宮頸癌患者宮頸活檢組織DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化率顯著高于正常人，與病情及預(yù)后密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 宮頸癌；DAPK1；甲基化

[中圖分類號(hào)] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）35-0016-02

研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與基因表達(dá)異常有關(guān)，其中基因甲基化導(dǎo)致基因表達(dá)下降是目前發(fā)現(xiàn)的基因突變外最重要發(fā)病機(jī)制[1]。死亡相關(guān)蛋白激酶1（death-associated protein kinase 1，DAPK1）為新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，在腫瘤的發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色，在多種腫瘤中可檢測(cè)到其甲基化抑制基因表達(dá)狀態(tài)[2，3]。本研究采用甲基化特異性PCR檢測(cè)宮頸癌患者和正常人DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化，研究DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化在宮頸癌中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2010年1月～2013年6月初治宮頸癌患者為研究目標(biāo)，經(jīng)臨床表現(xiàn)、癥狀體征、影像學(xué)、細(xì)胞學(xué)和（或）病理組織學(xué)確診為宮頸癌。本組研究對(duì)象包括80例宮頸癌患者，年齡32～78歲，平均（51.3±12.7）歲。另以同期健康體檢的50例正常女性為對(duì)照，年齡30～80歲，平均（51.5±13.3）歲。兩組研究對(duì)象在年齡等方面的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

1.2 材料與試劑

所有研究對(duì)象宮頸取活檢組織后立即提取基因組DNA，根據(jù)基因組DNA提取試劑盒操作說明進(jìn)行，提取的DNA立即行甲基化檢測(cè)或-20℃保存待檢。

1.3 DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)

采用甲基化特異性PCR檢測(cè)DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化。將提取的基因組DNA行重硫酸鹽轉(zhuǎn)化。引物采用在線引物設(shè)計(jì)軟件Methprimer（http：//www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi）設(shè)計(jì)。轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物行PCR擴(kuò)增，PCR序列見表1，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性12 min，95℃變性1 min，65℃退火45 s，72℃延伸45 s，共32個(gè)循環(huán)，最后一輪72℃延伸10 min。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。基因啟動(dòng)子甲基化與臨床病理因素的關(guān)系比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法計(jì)算P值，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

47例宮頸癌患者活檢組織檢測(cè)到DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化，甲基化率為58.8%，正常女性中2例檢測(cè)到DAPK1基因啟動(dòng)子呈甲基化，甲基化率為4.0%，宮頸癌患者宮頸活檢組織DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化率顯著高于正常女性（P < 0.05）。宮頸癌患者DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化率在年齡、吸煙史、酗酒史和病理類型方面無明顯差異（P > 0.05），在HPV感染、分化程度、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和Figo分期中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理因素宮頸活檢組織DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化的差異

3 討論

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)最主要的調(diào)控基因表達(dá)方式，甲基化可導(dǎo)致染色質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，甲基化CG或結(jié)合甲基結(jié)合蛋白后可阻遏轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，導(dǎo)致基因無法復(fù)制而抑制基因表達(dá)，因真核生物的CpG島主要分布于啟動(dòng)子區(qū)域，故目前研究DNA甲基化主要集中在基因啟動(dòng)子[4，5]。越來越多的研究證實(shí)，基因啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致基因表達(dá)下降，其甲基化率與腫瘤的病情及預(yù)后密切相關(guān)，較傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)水平的標(biāo)志物具有更高的靈敏度和特異性[6]。DAPK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，可調(diào)控細(xì)胞周期，可促進(jìn)正常細(xì)胞發(fā)生凋亡，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)[7]。目前研究發(fā)現(xiàn)，DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化在消化道腫瘤、呼吸系統(tǒng)腫瘤等眾多腫瘤中處于高甲基化、表達(dá)缺失狀態(tài)，且其甲基化與病情及預(yù)后相關(guān)，甲基化率越高意味著腫瘤患者病情越重、預(yù)后越差[8]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化發(fā)生率顯著高于正常女性，證實(shí)與其他腫瘤類似，宮頸癌患者存在DAPK1基因啟動(dòng)子高甲基化狀態(tài)。

在本研究中，腫瘤分化程度低、腫瘤直徑大、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及分期晚的患者宮頸活檢組織DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化率顯著高于分化程度高、腫瘤直徑小、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及分期早的宮頸癌患者，這些數(shù)據(jù)均表明DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化在宮頸癌病情及預(yù)后中具有一定價(jià)值。有研究表明DAPK1基因甲基化與HPV感染密切相關(guān)，花敏慧等[9]研究證實(shí)DAPK1甲基化是宮頸癌發(fā)生的早期事件，且其與高危型HPV感染呈正相關(guān)?；谀[瘤的分化程度和臨床分期與宮頸癌病情及預(yù)后密切相關(guān)這一事實(shí)，推測(cè)DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化可作為宮頸癌基因?qū)哟蔚臉?biāo)志物，可能在宮頸癌的診斷、病情與預(yù)后評(píng)估中扮演重要角色。此外，DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化或許能反應(yīng)HPV感染，尤其在無法直接取得HPV感染證據(jù)下檢測(cè)基因水平的DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化有利于對(duì)HPV治療做出評(píng)價(jià)。值得一提的是，目前尚無DAPK1與宮頸癌的相關(guān)研究，本研究?jī)H僅在臨床病理因素方面發(fā)現(xiàn)DAPK1與宮頸癌的關(guān)系，其具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 巫劍紅. 宮頸癌抑癌基因甲基化的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述，2012， 18（19）：3187-3190.

[2] 孫然，王凱臣，孫鴻燕，等. 膀胱癌患者癌組織和尿沉淀細(xì)胞抑癌基因DNA甲基化研究[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2012，29（10）：2054-2056.

[3] 游崇登. 抑癌基因DAPK甲基化在血液腫瘤中的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述，2012，18（7）：1040-1042.

[4] 白彧，杜智，高英堂，等. 肝細(xì)胞癌ASC基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化及其mRNA表達(dá)研究[J]. 中國(guó)腫瘤臨床，2011，38（8）：437-441.

[5] 但良英. BLU基因異常甲基化與腫瘤研究進(jìn)展[J]. 重慶醫(yī)學(xué)，2012， 41（9）：919-922.

[6] 鄭吉，凌志強(qiáng)，李波，等. 食管鱗癌患者血漿中DAPK基因異常甲基化及臨床意義研究[J]. 腫瘤學(xué)雜志，2013，19（5）：346-351.

[7] 王平，耿小平，朱立新，等. 肝細(xì)胞肝癌中外周血漿DNA基因甲基化檢測(cè)及意義[J]. 中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2012，19（7）：727-732.

[8] 吳魏芹，張曉媛，徐海鳳，等. 肺癌細(xì)胞DAPK基因啟動(dòng)子甲基化與吉非替尼敏感性的相關(guān)性研究[J]. 臨床腫瘤學(xué)雜志，2013，18（6）：481-485.

[9] 花敏慧，劉春花，張玉泉，等. 宮頸癌中DAPKⅠ、RARβ甲基化與高危型HPV感染的相關(guān)研究[J]. 南通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2011，31（2）：134-136.

（收稿日期：2013-10-17）