Th17細(xì)胞在小鼠H22原位肝癌模型中的表達(dá)和意義

[摘要] 目的 檢測小鼠原位肝癌模型中Th17細(xì)胞的表達(dá)，探討其在肝癌免疫中的作用。 方法 30只Balb/C小鼠隨機分為肝癌模型組（10只）、生理鹽水對照組（10只）、空白對照組（10只），流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠分離純化后的各組新鮮脾臟Th17細(xì)胞的相對比例；實時RT-PCR檢測各組肝組織IL-17基因和RORγT基因表達(dá)水平。 結(jié)果 肝癌模型組脾臟Th17/ CD4+T細(xì)胞的比例高于生理鹽水對照組脾臟、空白對照組脾臟，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），而各對照組之間的比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。肝癌模型組腫瘤組織IL-17 mRNA和RORγT mRNA的表達(dá)水平均高于各自對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），而IL-17 mRNA和RORγT mRNA在各自對照組之間表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 Th17細(xì)胞在小鼠原位肝癌模型中數(shù)量增多，IL-17表達(dá)升高，增強免疫反應(yīng)，但在肝癌免疫中的作用及機制復(fù)雜，有待深入研究。

[關(guān)鍵詞] 肝癌模型；Th17細(xì)胞；IL-17；RORγT

[中圖分類號] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）35-0005-03

肝細(xì)胞癌（hepatocellutar carcinoma，HCC）是世界上最多見的五大惡性腫瘤之一，死亡率列前三位[1]，我國是HCC多發(fā)國家。但目前以手術(shù)為主的綜合治療方法療效仍不理想，故近年來免疫治療越來越受到重視。

Th17細(xì)胞是一種以分泌IL-17為主要特征的CD4+T細(xì)胞，孤核受體RORγT是其特異的轉(zhuǎn)錄因子。Th17細(xì)胞首先是在EAE和CIA的研究中被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)研究表明IL-17的表達(dá)和人類很多自身免疫性疾病有關(guān)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病等[2-4]。最近研究發(fā)現(xiàn)，在一些腫瘤患者或小鼠腫瘤模型的腫瘤標(biāo)本中Th17細(xì)胞明顯升高，但是關(guān)于Thl7和HCC的研究，國內(nèi)鮮有見到相關(guān)的報道。故本研究通過建立Balb/C小鼠原位荷瘤模型，檢測脾臟中Th17細(xì)胞的比例、腫瘤微環(huán)境中IL-17基因和RORγT基因的表達(dá)，為能進一步系統(tǒng)地研究Th17細(xì)胞在肝癌免疫中的作用和機制打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物：6～8周齡SPF級雄性Balb/C小鼠，體重（20±2）g。30只小鼠隨機分為肝癌模型組、生理鹽水對照組、空白對照組，各10只進行實驗。

1.1.2腫瘤細(xì)胞株 鼠源性H22腹水型肝癌細(xì)胞株。

1.1.3抗體和試劑 FITC Rat Anti-Mouse CD4、PE Rat Anti-Mouse IL-17A購自美國BD公司；SYBR Green Supermix 購自美國Bio-rad，PCR引物由上海浦生生物科技有限公司合成。

1.2方法

1.2.1 小鼠原位肝癌模型的建立 H22肝癌細(xì)胞注入Balb/C小鼠腹腔，后抽取癌性腹水調(diào)整細(xì)胞濃度備用。肝癌模型組：小鼠麻醉后，開腹直視下將0.01 mL癌細(xì)胞懸液注入肝臟。生理鹽水對照組：肝內(nèi)注入0.01 mL生理鹽水。模型制作后第30天處死小鼠取肝臟腫瘤組織固定，常規(guī)HE染色， 進行病理組織學(xué)診斷。

1.2.2 Th17細(xì)胞流式檢測 ①取肝癌模型組、生理鹽水對照組、空白對照組脾臟，機械法分離細(xì)胞，紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞。②獲得的各組脾臟單個核細(xì)胞按照免疫磁珠操作規(guī)程分選CD4+T細(xì)胞。③CD4+T細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，加入PMA，Ionomycin，Monensin，使其終濃度分別為125 ng/mL，1 μg/mL 和1。6 μg/mL，在37℃、5%二氧化碳的環(huán)境下培養(yǎng)4h。④取細(xì)胞懸液，先后加入CD3-PE-CY5，F(xiàn)ITC Rat anti-mouse CD4標(biāo)記細(xì)胞表面抗原，PE Rat Anti-Mouse IL-17A胞內(nèi)染色，設(shè)同型對照組。用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測，以CD4，IL-17A雙陽性細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比記錄結(jié)果。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測 Trizol法提取各組總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。由SYBR Green Supermix，forward primer，reverse primer，cDNA等試劑建立一個10 μL 的反應(yīng)體系（引物設(shè)計見表1），放入ABI高通量熒光定量PCR儀7900HT進行反應(yīng)，反應(yīng)條件：開始50℃ 2 min ，95°C 10 min，接著95°C 15 s 和 60°C 1 min共45個循環(huán)。最后根據(jù)待測基因和內(nèi)參的循環(huán)數(shù)CT值，使用2 -△△CT方法進行相對定量結(jié)果分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較均采用單因素方差分析，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1小鼠原位肝癌模型建立

病理檢查示肝癌組織正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失，瘤細(xì)胞異型性明顯，大小、形態(tài)不一，核大、深染，腫瘤細(xì)胞排列緊密， 與周圍的肝組織分界較為明顯，腫瘤組織壞死明顯（圖1）。

2.2流式檢測Th17細(xì)胞的相對比例

肝癌模型組脾臟Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例（1.79±0.45）%高于空白對照組脾臟（0.17±0.17）%和生理鹽水對照組脾臟（0.20±0.09）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），而空白對照組脾臟、生理鹽水對照組脾臟之間Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），見表2和圖2。

2.3 IL-17基因和RORγT基因表達(dá)檢測結(jié)果

2.3.1 肝癌模型組腫瘤組織IL-17mRNA的表達(dá) 其水平（3.70±0.43）高于空白對照組肝臟組織（0.79±0.13），生理鹽水對照組肝臟組織（0.84±0.39）和肝癌模型組癌旁遠(yuǎn)端組織（0.70±0.27），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），而各對照組之間IL-17mRNA的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）（表3）。

2.3.2 肝癌模型組腫瘤組織RORγTmRNA的表達(dá)水平 其水平（14.63±4.28）高于空白對照組肝臟組織（7.63±0.64），生理鹽水對照組肝臟組織（7.86±1.77）和肝癌模型組癌旁遠(yuǎn)端組織（9.92±2.74），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），而各對照組之間RORγTmRNA的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）（表3）。

表1 IL-17基因和 RORγT基因引物設(shè)計

注：F：上游引物，R：下游引物

表2 各組脾臟Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的相對比例（x±s）

注：肝癌模型組與各對照組（標(biāo)記*）比較，F(xiàn)=43.570，P < 0.01

表3 腫瘤組織及各組肝臟組織中IL-17mRNA及RORγTmRNA的表達(dá)（x±s）

注：肝癌模型組與各自相應(yīng)的對照組（標(biāo)記*）比較，aF = 200.110 ，aP < 0.01； bF = 14.369 ，bP < 0.01

3 討論

肝癌患者的細(xì)胞免疫功能受到抑制，機體的細(xì)胞免疫機制可以控制肝癌的發(fā)生和發(fā)展， CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞有直接殺傷肝癌細(xì)胞的作用，CD4+T細(xì)胞則是調(diào)控CTL功能的重要細(xì)胞。Th17細(xì)胞是一種分化途徑不同于Thl和 Th2型細(xì)胞的CD4+T細(xì)胞。

目前關(guān)于Th17細(xì)胞在腫瘤免疫中的作用知道的還較少，其在不同腫瘤環(huán)境的作用不盡相同。如卵巢癌患者和正常人外周血中Th17細(xì)胞比例的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中，Th17細(xì)胞的比率顯著上升[5]；Zou[6]研究發(fā)現(xiàn)在B16黑素瘤晚期表達(dá)水平明顯增高，且在外周血、骨髓、脾臟及癌組織中均升高。關(guān)于Th17細(xì)胞和肝癌的關(guān)系，曾有一項研究報道，Th17細(xì)胞水平增高與腫瘤大小、門脈癌栓、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期有明顯關(guān)系[7]。

本實驗主要研究肝癌環(huán)境中的Th17細(xì)胞。首先研究了肝癌模型中脾臟Th17細(xì)胞的表達(dá)，和各對照組相比，表達(dá)明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)差異。但HCC轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為和不良預(yù)后很大程度上可能被局部的炎癥狀態(tài)所決定或影響[8]，所以對腫瘤微環(huán)境中Th17細(xì)胞進行檢測很重要。結(jié)果顯示IL-17mRNA和RORγTmRNA的表達(dá)水平，和各對照組相比，均明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)差異。IL-17作為Th17細(xì)胞分泌的最特征性細(xì)胞因子，RORγT是控制Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，腫瘤組織中IL-17mRNA和RORγTmRNA表達(dá)水平的升高從基因水平證實Th17細(xì)胞在腫瘤組織中是升高的。實驗結(jié)果提示Th17細(xì)胞在HCC腫瘤微環(huán)境和外周免疫器官的變化存在一致性。

國外最近相似的研究結(jié)果顯示，Th17細(xì)胞在腫瘤組織內(nèi)的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，是HCC預(yù)后差的獨立危險因素，而且瘤內(nèi)的Th17細(xì)胞與腫瘤的微血管密度呈正相關(guān)，提示Th17細(xì)胞通過培養(yǎng)血管生成促進腫瘤進展[9]。HCC是一種典型的慢性炎癥背景上發(fā)生的惡性腫瘤，以前研究表明，STAT3信號通道及IL-23等重要細(xì)胞因子與癌癥相關(guān)性炎癥有關(guān)，而Th17細(xì)胞與它們關(guān)系密切，有可能成為癌癥治療的新靶點[10]。

以上報道提示Th17細(xì)胞促進腫瘤進展，但也有抗腫瘤作用的相關(guān)報道。在肝癌患者的腫瘤組織內(nèi)CCL20顯著增多，Th17細(xì)胞表達(dá)CCR6，二者可特異性結(jié)合誘導(dǎo)Th17細(xì)胞遷移，而腫瘤微環(huán)境中的TNF-α、IL-17A等又可促進CCL20的分泌，并通過CCL20/CCR6依賴的方式來募集Th17細(xì)胞[11]。 Th17細(xì)胞可以通過CCR6/CCL20途徑調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞募集來間接發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)[12]。由此可以推測肝癌中Th17細(xì)胞可通過CCR6/CCL20途徑間接發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)，而且提示Th17細(xì)胞的分化和遷移與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)，并通過腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子聯(lián)系起來。

Thl7細(xì)胞分泌IL-17，IL-22等多種細(xì)胞因子。IL-17主要由Th17細(xì)胞產(chǎn)生，通常所說的IL-l7就是指IL-17A。IL-17作為一類重要的炎性細(xì)胞因子，可以與多種細(xì)胞表面的IL-17受體結(jié)合并激活它們，進而釋放多種細(xì)胞因子、趨化因子以及炎性介質(zhì)，并促進細(xì)胞表面粘附分子的表達(dá)，因此具有增強免疫反應(yīng)的作用，這是比較確切的。但相關(guān)文獻(xiàn)報道肝癌患者瘤內(nèi)IL-17的表達(dá)升高和HCC患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)[13]，還有研究表明肝腫瘤切除后殘余肝組織中存在的產(chǎn)生IL-17的T細(xì)胞可能加重局部肝損傷[14]，提示IL-17在肝癌中發(fā)揮著重要作用。國外有項研究發(fā)現(xiàn)，IL-17在體外能增強肝癌細(xì)胞的侵襲能力，在體內(nèi)可明顯促進肝癌荷瘤小鼠腫瘤局部血管形成和對中性粒細(xì)胞的招募，從而起到促進腫瘤生長的目的[15]。但近段時間又發(fā)現(xiàn)IL-17可以通過促進腫瘤組織中樹突狀細(xì)胞的產(chǎn)生，促進腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞活性來參與抗腫瘤免疫。所以IL-17在肝癌抗腫瘤活性的機制很大程度上還是未知的。

綜上所述，Th17細(xì)胞在小鼠肝癌模型中數(shù)量增多，IL-17表達(dá)升高，增強免疫反應(yīng)。但同時可以看出Th17細(xì)胞具有多效性，在肝癌中的作用復(fù)雜，IL-17在肝癌中的作用及機制等仍不明確。我們希望通過后續(xù)實驗的深入研究，能為肝癌的免疫治療提供新的思路。

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（收稿日期：2013-10-09）