纖支鏡毛刷細(xì)胞塊技術(shù)的應(yīng)用方法和價(jià)值

[摘要] 目的 探討纖支鏡毛刷細(xì)胞塊技術(shù)的應(yīng)用方法和價(jià)值。 方法 對(duì)32例纖支鏡毛刷常規(guī)涂片后再將剩余細(xì)胞用10%中性福爾馬林固定制成細(xì)胞蠟塊（cell block，CB），先行常規(guī)HE染色，再根據(jù)需要選擇酶標(biāo)行免疫組化。 結(jié)果 CB常規(guī)HE染色細(xì)胞清晰，有一定的組織學(xué)結(jié)構(gòu)，有利于明確診斷；免疫組化則陽性定位準(zhǔn)確，著色清晰，對(duì)腫瘤分型效果較好。兩種染色方法染色效果均好于常規(guī)涂片，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），與肺活檢及術(shù)后組織切片差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 用10%中性福爾馬林固定的纖支鏡毛刷CB的制作方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、染色效果好，在診斷肺疾病、特別是肺腫瘤中有較高的實(shí)用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景，值得推廣。

[關(guān)鍵詞] 纖支鏡毛刷；細(xì)胞塊；常規(guī)HE染色；免疫組化；10%中性福爾馬林

[中圖分類號(hào)] R446.6；R361.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）36-075-03

The application methods and value of fiber lens brush cell block technique

ZHANG Guizhen ZHU Zhenda CHEN Cheng

Department of Pathology， Yuhang District Traditional Chinese Medicine Hospital of Hangzhou City in Zhejiang Province， Hangzhou 311106， China

[Abstract] Objective To study the application methods and value of fiber lens brush cell block technique. Methods For 32 cases of fiber lens brush after conventional smear in the remaining cells again fixed with 10% formaldehyde wax block made from cells （cell block， CB）， the first routine HE staining， again to choose according to the need to enzyme immunohistochemical marking line. Results CB routine HE staining cells clear， histologic structure to a certain extent， was conducive to clear diagnosis； Immunohistochemical positive for accurate positioning， color clear， has good effect for tumor classification. Two dyeing methods were better than regular smear dyeing effect， so the significant difference of statistically was significant （P < 0.01）， and the lung biopsy and postoperative biopsy difference was not significant （P > 0.05）. Conclusion The production method of the fiber lens brush CB fixed with 10% of formaldehyde is simple， economic and The dyeing effect is good， in the diagnosis of pulmonary diseases， especially lung cancer has a high practical value and broad application prospect， the production method is worth promoting.

[Key words] Fiber lens brush； Cell block； Routine HE staining； Immunohistochemical； 10% formaldehyde

纖支鏡毛刷細(xì)胞學(xué)檢查是診斷肺疾病、特別是肺腫瘤的重要手段之一，已被廣泛用于臨床，當(dāng)纖支鏡活檢和經(jīng)皮肺穿刺活檢由于多種因素被迫放棄，此時(shí)的纖支鏡毛刷細(xì)胞學(xué)檢查是術(shù)前最佳的病理檢查方法，顯得尤為重要，并對(duì)已不適合手術(shù)治療的老弱患者和晚期癌癥患者來說也是較佳的病理檢查方法。筆者對(duì)32例纖支鏡毛刷常規(guī)涂片后再將剩余細(xì)胞制成細(xì)胞蠟塊（cell block，CB），先行常規(guī)HE染色鏡下觀察，再根據(jù)需要選擇酶標(biāo)行免疫組化（如CEA、LCA、CK5/6、CK7、CgA、Syn、P63、34βE12、TTF-1等），兩者結(jié)合觀察，對(duì)肺疾病進(jìn)行病理診斷，特別是對(duì)肺腫瘤進(jìn)行組織學(xué)上的分型，效果較好，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

50 mL尖底塑料試管1支，直立平衡離心機(jī)1臺(tái)，盛10 mL 10%中性福爾馬林的小瓶1只，老虎鉗1把，震蕩器1臺(tái)。

1.2 方法

1.2.1 毛刷處理 毛刷刷取細(xì)胞后快速涂片2張，95%乙醇迅速固定，常規(guī)HE染色。涂片后馬上用老虎鉗剪斷毛刷放入盛有10 mL的10%中性福爾馬林的瓶?jī)?nèi)固定。

1.2.2 制片方法 毛刷在10%中性福爾馬林液固定1 h后用干凈的鑷子取出，用針尖挑（或刮）出刷內(nèi)物，盡量挑干凈，再把毛刷在固定液內(nèi)漂洗，而后把固定液倒入試管內(nèi)。再重新倒入10 mL左右的10%中性福爾馬林在瓶?jī)?nèi)，在震蕩器上震下刷內(nèi)殘余的細(xì)胞，再把這10 mL的中性福爾馬林倒入同試管內(nèi)，再加一定的量，使試管內(nèi)的福爾馬林總量達(dá)30～40 mL，離心3000 r/min、15 min，取出放在試管架上固定2～4 h左右，如標(biāo)本上午送來的則當(dāng)天即可與常規(guī)組織同脫水，如下午兩三點(diǎn)后送來則固定過夜。固定好后倒去固定液，此時(shí)沉淀物已結(jié)塊，小心取出，放在濾紙上滴入伊紅包好，與常規(guī)組織同時(shí)進(jìn)行脫水、包埋予0.4 mm厚連續(xù)切片8張左右，其中1張常規(guī)HE染色鏡下觀察，再根據(jù)需要選擇酶標(biāo)行免疫組化。

1.2.3 染色合格標(biāo)準(zhǔn) 將常規(guī)HE合格標(biāo)準(zhǔn)定為：細(xì)胞清晰，核漿對(duì)比分明，組織學(xué)結(jié)構(gòu)可有（或無），有利于明確診斷。將免疫組化合格標(biāo)準(zhǔn)定為：陽性定位準(zhǔn)確，著色清晰，有助于腫瘤的分型。

1.2.4 免疫組化方法 CEA、LCA、CK5/6、CK7、CgA、Syn、P63、 34βE12、TTF-1等單克隆抗體購于北京中杉公司，實(shí)驗(yàn)流程采用EnVision二步法。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。用Kolmegorov-Smirnov方法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，使用χ2檢驗(yàn)對(duì)正態(tài)分布的構(gòu)成比進(jìn)行比較，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

40例肺纖支鏡毛刷，先直接常規(guī)涂片，再將剩余細(xì)胞用10%中性福爾馬林固定制成細(xì)胞蠟塊（CB），除8例由于細(xì)胞數(shù)量過少或血過多等原因使CB制作失敗外，成功的32例常規(guī)HE染色效果較好，細(xì)胞較清晰，有一定的組織結(jié)構(gòu)；免疫組化則陽性定位準(zhǔn)確、著色較清晰，與常規(guī)涂片相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）、與肺活檢（或術(shù)后組織切片）相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

表1 三種不同方法檢測(cè)結(jié)果比較[n（%）]

圖1、2 CB中的片狀異型鱗狀上皮組織，HE，×10與×40

圖3 CB中的正常腺管狀結(jié)構(gòu)，HE，×40

圖4 CB中的支氣管黏膜，×10

圖5 活檢中的支氣管黏膜，×10

圖6 術(shù)后常規(guī)切片對(duì)照，HE，×40

圖7 直接常規(guī)涂片對(duì)照，HE，×40

圖8 34βE12在CB中的（與圖1同片）陽性表達(dá)，Envision法，×10

圖9 34βE12在直接常規(guī)涂片中的陽性表達(dá)，Envision法，×10

圖10 34βE12在術(shù)后常規(guī)切片中的陽性表達(dá)，Envision法，×10

圖11 CB中的片狀鱗狀上皮（右下）與壞死組織（左上）分界清，×10

圖12 術(shù)后切片中的鱗狀上皮（上）與壞死組織（下）分界清，×10

3 討論

3.1 纖支鏡毛刷細(xì)胞塊的HE染色效果

本方法制作的CB在HE染色上與文獻(xiàn)報(bào)道[1]的相似：細(xì)胞境界、核膜、核染質(zhì)、核仁清楚；也有一定的巢狀、片狀、管狀結(jié)構(gòu)組織學(xué)結(jié)構(gòu)和排列方式[2]（圖1、2、3、4），等同活檢（圖5）和術(shù)后切片（圖6）的圖像，兩者染色效果對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。而直接常規(guī)涂片最大的缺陷是細(xì)胞量少，很難看到組織學(xué)結(jié)構(gòu)[3]，我們觀察的病例大多似此，且常伴有細(xì)胞退變（圖7），常與壞死物、血細(xì)胞混合，干擾細(xì)胞的分辨，給診斷帶來一定的困難，兩者染色效果對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。

3.2 纖支鏡毛刷細(xì)胞塊的免疫組化效果

本方法制作的CB在免疫組化上陽性定位準(zhǔn)確，著色清晰，背景也清晰無干擾（圖8），與活檢和術(shù)后切片（圖10）相似，兩者染色效果對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。而常規(guī)涂片免疫組化出現(xiàn)高背景染色，細(xì)胞集群呈三維結(jié)構(gòu)，尤其是膜著色的更難判斷[4]，著色有模糊朦朧（圖9）的感覺，給判斷帶來一定的困難，兩者染色效果對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。

3.3 纖支鏡毛刷細(xì)胞塊的制作體會(huì)

纖支鏡毛刷常規(guī)涂片后再把毛刷內(nèi)殘留的物質(zhì)挑（或刮）出再離心制成細(xì)胞塊，優(yōu)良的纖支鏡毛刷技術(shù)和小心、耐心挑（或刮）出刷內(nèi)殘留物使有足夠量的腫瘤細(xì)胞是成功制成CB的主要環(huán)節(jié)。毛刷內(nèi)物固定1 h左右后有一定硬度，易于挑（或刮）出，刷內(nèi)物直接挑（或刮）出，對(duì)成小片狀、小粒狀刷下組織的破壞較小，很好地保存了原有的組織學(xué)結(jié)構(gòu)（圖4），再利用離心機(jī)的離心力把漂下、震下的分散細(xì)胞經(jīng)過高度濃縮壓緊，也一定程度地顯示了組織學(xué)模式，并能顯示涂片中不能顯示的特征性組織結(jié)構(gòu)，如鱗癌的角化珠、乳頭狀結(jié)構(gòu)、腫瘤的組織間質(zhì)等[5]，又如我們觀察到的片狀上皮成分與壞死組織分界清（圖11）及較完整的黏膜結(jié)構(gòu)（圖4）的圖像，與活檢（圖5）和術(shù)后切片（圖6、圖12）極其相似，且又不浪費(fèi)所刷取的任何材料。而直接常規(guī)涂片最大的缺陷是材料浪費(fèi)，細(xì)胞量少，又很難看到組織學(xué)結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)雖有較先進(jìn)的液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)，但經(jīng)過振蕩，標(biāo)本中組織學(xué)結(jié)構(gòu)大部分被離散，涂片中也很難看到組織學(xué)結(jié)構(gòu)，又經(jīng)過膜式過濾后，細(xì)胞量也相應(yīng)減少，對(duì)刷取的材料仍有浪費(fèi)。

我們不用95%乙醇固定，用10%中性福爾馬林固定，是因?yàn)楦邼舛鹊囊掖伎墒菇M織細(xì)胞收縮和變脆，難以切片外，還可溶解紅細(xì)胞中的血紅蛋白[6]，在免疫組化染色時(shí)會(huì)干擾背景加重背景著色。有文獻(xiàn)報(bào)道脫落細(xì)胞有完整的細(xì)胞膜，雖經(jīng)乙醇固定，其包膜上的類脂質(zhì)不能充分溶解，影響試劑的滲透造成真正的陽性細(xì)胞著色不良，影響結(jié)果判斷[7，8]。10%中性福爾馬林對(duì)組織滲透作用強(qiáng)，固定均勻、穩(wěn)定，使組織具有一定的彈性，不僅易于切片外，還能很好地保存組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、保存大部分組織細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)如糖類、無機(jī)鹽、色素、蛋白抗原等，使抗原定位更加清晰，尤其是對(duì)細(xì)胞核的抗原固定最佳[9]，利于進(jìn)行免疫組化染色和分子生物學(xué)檢驗(yàn)。我們制作和觀察的病例大多有類似的結(jié)果，免疫組化效果較佳（圖10）。但福爾馬林滲透速度較乙醇慢，所以固定時(shí)間較長(zhǎng)，一般要2～4 h[10]，如果急需加快，也可采用付海洋等[9]介紹的方法：在前固定的基礎(chǔ)上再利用超聲波進(jìn)行后固定，加速福爾馬林對(duì)細(xì)胞的滲透和固定。另有文獻(xiàn)報(bào)道常規(guī)涂片免疫組化細(xì)胞成分復(fù)雜，除有較強(qiáng)的非特異性背景著色外，三維細(xì)胞團(tuán)免疫試劑容易進(jìn)入產(chǎn)生假陽性[11]；CB免疫組化染色則背景干凈，幾乎沒有假陽性[12]。

3.4 纖支鏡毛刷細(xì)胞塊的應(yīng)用前景

細(xì)胞塊作為細(xì)胞學(xué)診斷中重要的輔助手段最初應(yīng)用于胸腹水、心包積液等液體標(biāo)本，在國外該技術(shù)已經(jīng)成為脫落細(xì)胞學(xué)的常規(guī)操作技術(shù)，并已應(yīng)用很久，目前國外普遍采用自動(dòng)化制作細(xì)胞蠟塊，但該方法設(shè)備成本較高且技術(shù)較為復(fù)雜[13]。傳統(tǒng)的細(xì)胞塊制作方法有瓊脂或生物膠水包埋法、固定沉降法、血漿凝血酶凝集法、雞蛋清凝集法和醫(yī)用脫脂棉吸附法，不僅操作復(fù)雜，且通透性較差，影響脫水、透明和浸蠟，造成制片困難和染色效果差[14，15]。我們制作的方法較為簡(jiǎn)便，只需1臺(tái)離心機(jī)用10%中性福爾馬林固定，2～3 d即可完成常規(guī)HE染色和免疫組化染色，并因未用任何媒介物，干擾圖像較少，染色效果較佳，更易于鏡下觀察。CB還有優(yōu)點(diǎn)是可以連續(xù)切片，用于多種酶標(biāo)檢測(cè)，如CEA、LCA、CK5/6、CK7、CgA、Syn、P63、34βE12、TTF-1等診斷肺腫瘤的酶標(biāo)均可用上，以滿足診斷需要。并可長(zhǎng)期保存，其成本對(duì)實(shí)驗(yàn)而言也是最經(jīng)濟(jì)的。已有文獻(xiàn)報(bào)道CB用于原位雜交檢測(cè)定位準(zhǔn)[16]，因條件限制，我們尚未開展，但是我們以后努力的方向。所以用10%中性福爾馬林固定的纖支鏡毛刷CB方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、效果好，在診斷肺疾病、特別是肺腫瘤中有廣闊的應(yīng)用前景，值得推廣。

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（收稿日期：2013-07-15）