骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠損傷汗腺的修復(fù)性研究

[摘要] 目的 探討皮膚汗腺受損后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對其的修復(fù)效果。方法 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)、標(biāo)記。機(jī)械損傷大鼠腳掌汗腺，干細(xì)胞治療組于創(chuàng)面周圍皮下注入MSCs，對照組注射相同劑量PBS，分別比較兩組的創(chuàng)面愈合率及再生上皮的厚度，觀察MSCs參與受損汗腺修復(fù)的情況。結(jié)果 7 d時干細(xì)胞治療組的創(chuàng)面愈合率及14 d時的表皮再生厚度均優(yōu)于對照組（P<0.05）；BrdU標(biāo)記的MSCs參與了損傷汗腺導(dǎo)管部的修復(fù)。結(jié)論 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有利于創(chuàng)傷皮膚的修復(fù)并可能參與損傷汗腺的修復(fù)。

[關(guān)鍵詞] 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；損傷修復(fù)；汗腺

[中圖分類號] R64 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）36-0007-03

The study of the participation of MSCs in the repair of injured skin and sweat glands in rats

WANG Jun ZHANG Haifeng SHEN Xiaoling LI Cunbao

Basic Medical College of Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010110， China

[Abstract] Objective To explore the repair effects of injured skin and sweat glands. Methods Rats MSCs were isolated，grown and labelled in vitro. The model of injured sweat glands of sales was made in rats. The 5-BrdU-labelled mesenchyme stem cell（MSCs） suspension was injected in rats of experimentation group，and PBS with the equivalent volume in rats of the control group. The sole tissues were required and underwent HE staining from the two groups. The immunochemical staining was performed to observe the distribution of MSCs in the injured area. Results The healing ratio and the depth of re-epithelialization in experimentation group were both higher than the control group（P<0.05）. Immunochemical staining showed BrdU-positive cells in the sweat gland ducts during the healing process. Conclusion Mesenchyme stem cells may participate in the healing process of injured skin and sweat glands.

[Key words] Mesenchymal stem cells； Wound repair； Sweat glands

近十余年來組織工程學(xué)的發(fā)展為大面積皮膚缺損的修復(fù)開辟了新的途徑，大量人工皮膚的問世雖然可以實現(xiàn)外觀的修復(fù)但不能滿足根本的功能需要，存在的一個共同問題是均不能重建毛囊、皮脂腺、汗腺等皮膚附屬器，降低了皮膚對環(huán)境的適應(yīng)能力。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）多向分化潛能的深入研究，使得重建損傷皮膚附屬器成為可能。本實驗觀察MSCs對于大鼠腳掌損傷汗腺的修復(fù)情況，期望以此為基礎(chǔ)實現(xiàn)皮膚功能的完全修復(fù)。

1 材料與方法

1.1 MSCs的分離、純化及傳代

無菌條件下取成年雄性Wistar大鼠（由中科院實驗動物所提供）兩側(cè)股骨，用含有胎牛血清（體積分?jǐn)?shù)為10%）的DMEM培養(yǎng)液沖出骨髓細(xì)胞，1000 rpm/min離心7 min，DMEM重懸，以2×105 cm2細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，2 d后更換培養(yǎng)基，棄除未貼壁細(xì)胞。以后每隔2～3天細(xì)胞換液1次。細(xì)胞達(dá)80%融合后用2.5 g/L的胰蛋白酶和0.2 g/L的乙二胺四乙酸（EDTA）于37℃消化，然后以1∶3的比例接種于新的培養(yǎng)瓶進(jìn)行傳代擴(kuò)增。

1.2 MSCs的標(biāo)記

在傳至第三代后，以含5 μmol/mL 5-溴脫氧尿嘧啶（5-BrdU，美國Sigma公司）的上述培養(yǎng)液孵育。移植前0.25%胰酶（含0.02% EDTA）室溫下消化、800 rpm離心10 min、磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗3遍，并同時調(diào)整細(xì)胞濃度為4.0×106/mL。

1.3 動物分組及模型制備

Wistar雄性大鼠100只，平均體重200 g 左右（由內(nèi)蒙古大學(xué)動物實驗中心提供）。隨機(jī)分為干細(xì)胞治療組和對照組。氯胺酮（10 mg/kg）腹腔注射麻醉，75%乙醇消毒，無菌刀片輕刮雙側(cè)腳掌，造成皮膚汗腺的損傷。干細(xì)胞治療組于創(chuàng)傷周圍組織皮下注入300 μL MSCs細(xì)胞懸液，對照組注入等體積PBS。無菌紗布覆蓋。分別于處理后的7 d和14 d，每組取出25只大鼠，切除創(chuàng)傷腳掌，4%多聚甲醛固定，去除骨組織，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，備用。

1.4 HE染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，用蘇木精-伊紅（HE）染色法染色，光鏡下觀察。比較7 d時兩組的創(chuàng)面愈合率，觀察14 d時兩組新生上皮增生情況，通過顯微鏡目鏡測微器測量再生的表皮厚度。

1.5 免疫組織化學(xué)染色

采用二步法對連續(xù)切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，嚴(yán)格按照中杉公司提供的免疫組織化學(xué)染色試劑盒說明書操作。鼠抗BrdU單克隆抗體（北京中杉公司）工作濃度1∶100，室溫下孵育4 h，洗片，加羊抗鼠二抗（北京中杉公司），室溫下孵育2 h、洗片，3，3 二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果，細(xì)胞核呈棕黃色者為BrdU陽性細(xì)胞。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

治療組、對照組14 d再生上皮的厚度以（x±s）表示，組間差異采用t檢驗，7 d愈合率用卡方檢驗進(jìn)行比較，使用SPSS11.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

骨髓MSCs原代經(jīng)過2 d培養(yǎng)后有少量貼壁細(xì)胞，3 d可見多個貼壁細(xì)胞的克隆，細(xì)胞成梭形，細(xì)胞核大，胞漿豐富（圖1 A）。培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞迅速增殖（圖1 B），11 d后出現(xiàn)細(xì)胞融合及重疊，14 d可傳代，傳代后細(xì)胞于24 h內(nèi)完全貼壁。傳3代后MSCs生長達(dá)到最佳狀態(tài)。

圖1 鼠MSCs培養(yǎng)第3 天（A，倒置相差顯微鏡）和第7天（B，倒置相差顯微鏡）形態(tài)；BrdU標(biāo)記（C，DAB染色）

移植前對標(biāo)記細(xì)胞MSCs進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)染色（圖1 C），以鑒定其標(biāo)記比例。結(jié)果顯示BrdU標(biāo)記的MSCs陽性率達(dá)90%以上，達(dá)到移植要求。

實驗處理7 d后，組織切片HE染色顯示，組織間炎癥細(xì)胞浸潤，干細(xì)胞治療組創(chuàng)面完全愈合，明顯優(yōu)于對照組創(chuàng)面愈合率（100% vs 72%，χ2=5.98，P<0.05）， 且明顯出現(xiàn)角質(zhì)層（表1，圖2 A，B）。實驗處理14 d后炎癥反應(yīng)逐漸消退，干細(xì)胞治療組中表皮層厚度為（82.560±9.815）μm，略有表皮角形成，優(yōu)于對照組創(chuàng)面再生表皮厚度（54.280±8.672）μm（t=3.972，P<0.05），見表2，圖2 C，D。

免疫組化染色結(jié)果顯示，干細(xì)胞治療組在創(chuàng)傷14 d后，真皮層中可見散在分布BrdU陽性細(xì)胞，且在汗腺導(dǎo)管處易觀察到BrdU陽性細(xì)胞，可見其所標(biāo)記的MSCs可能參與了損傷汗腺導(dǎo)管的修復(fù)。對照組中未發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象（圖2 E，F(xiàn)）。

表1 7 d愈合率

注：χ2=5.98，P<0.05

表2 14 d再生表皮厚度的差異

注：t=3.972，P<0.05

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞在一定的條件下可以分化為多樣的細(xì)胞譜系，如肌腱細(xì)胞[1]、骨細(xì)胞[2]和軟骨等[3]。這種能夠產(chǎn)生多種效能的細(xì)胞不僅來源于骨髓組織同時可來源于非骨髓組織，如胎兒臍血、脂肪組織[4]、肌肉組織和牙髓。這些細(xì)胞因為其與宿主高度的同一性，因此具有較低的免疫原性。近年來，對于干細(xì)胞的潛在治療應(yīng)用被廣泛的研究，研究人員普遍認(rèn)為，大量健康干細(xì)胞的分離獲取，選擇更方便的治療路徑，規(guī)范干細(xì)胞分化為特定的細(xì)胞類型是在干細(xì)胞治療過程中極為重要的環(huán)節(jié)。

近年來MSCs應(yīng)用于皮膚疾病的治療得到大量報道，尤其是其在實驗?zāi)Ｐ突蚺R床研究中，對于創(chuàng)傷皮膚的修復(fù)作用更是引起了人們的重視。人們普遍認(rèn)為這一細(xì)胞可以成為創(chuàng)面修復(fù)過程中重要的基質(zhì)細(xì)胞，將成為今后細(xì)胞治療創(chuàng)面修復(fù)的重要方式。MSCs對于創(chuàng)傷皮膚的治療主要通過其直接參與了組織細(xì)胞的分化，同時為周圍細(xì)胞的修復(fù)提供了一個微環(huán)境，通過對于炎性細(xì)胞分泌的細(xì)胞活性因子及干細(xì)胞壁龕實現(xiàn)對于創(chuàng)傷皮膚的再生。同時其產(chǎn)生了大量的生長因子和免疫調(diào)節(jié)因子，對于創(chuàng)面的愈合恢復(fù)表現(xiàn)為積極的作用[5]。目前對于皮膚創(chuàng)傷的治療更多的還是考慮創(chuàng)面的恢復(fù)，表皮層的有效覆蓋。但我們也清晰地認(rèn)識到，皮膚修復(fù)是一個復(fù)雜的過程，單純皮膚結(jié)構(gòu)的解剖學(xué)恢復(fù)，不能解決因皮膚缺損而引起的功能學(xué)障礙，如何真正的實現(xiàn)皮膚的功能的恢復(fù)和重建，是當(dāng)今對于皮膚創(chuàng)傷修復(fù)研究的重要任務(wù)[6]。

結(jié)合皮膚正常的生理結(jié)構(gòu)和功能，我們認(rèn)為，對于皮膚附屬器的重建又以汗腺的功能重建最為重要。而MSCs在與汗腺細(xì)胞的共培養(yǎng)和其在體外誘導(dǎo)汗腺細(xì)胞的分化[7，8]，使得我們認(rèn)識到，利用干細(xì)胞的特定分化的特性和周圍微環(huán)境對于其誘導(dǎo)分化的影響，通過調(diào)控MSCs增殖分化潛能的細(xì)胞外微環(huán)境，誘導(dǎo)其分化，以重建皮膚附屬器，實現(xiàn)真正意義上的創(chuàng)傷皮膚的解剖學(xué)和功能學(xué)的恢復(fù)。

通過實驗研究我們發(fā)現(xiàn)，MSCs可以促進(jìn)創(chuàng)傷皮膚的修復(fù)，創(chuàng)面的恢復(fù)速度和再生上皮的厚度均明顯的優(yōu)于對照組，與當(dāng)前的研究相吻合[9]。在修復(fù)的過程之中其不但參與了皮膚組織結(jié)構(gòu)的重建，同時參與了受損汗腺的修復(fù)重建，對于提升創(chuàng)面修復(fù)質(zhì)量起到積極的促進(jìn)作用。雖然在當(dāng)前的研究中，我們還未能實現(xiàn)大量的MSCs參與受損汗腺的修復(fù)過程，且不能明確其是否實現(xiàn)了功能性的修復(fù)，但至少為今后的研究奠定了進(jìn)一步基礎(chǔ)，具有重要的現(xiàn)實意義和臨床意義。然而當(dāng)前我們并未實現(xiàn)受損皮膚真正的“功能型”恢復(fù)，且MSCs誘導(dǎo)分化的確切機(jī)制仍然不是很明確，仍需進(jìn)一步的研究。但是，當(dāng)前對于皮膚生物學(xué)的研究不斷深入，MSCs臨床治療的不斷探討，可以預(yù)見的是，在今后MSCs必將成為一個重要的臨床治療手段，并在皮膚創(chuàng)傷的治療中展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

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（收稿日期：2013-11-08）