生精湯對(duì)乳腺癌MCF—7細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究

[摘要] 目的 觀察生精湯對(duì)雌激素依賴性乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響，揭示生精湯的雌激素活性。 方法 選用乳腺癌MCF-7細(xì)胞株，應(yīng)用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) （E-SCREEN法）來檢測生精湯的雌激素作用。實(shí)驗(yàn)可分為空白對(duì)照組與雌激素對(duì)照組（己烯雌酚，30 μg/mL）和生精湯低、中、高劑量組（分別為500、800、1000 μg/mL），觀察給藥前后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并運(yùn)用四唑鹽比色法（MTT法）測定乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖率。 結(jié)果 生精湯高、中、低劑量組均可明顯提高乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖率，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。 結(jié)論 生精湯能顯著提高乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖率，即具有明顯的雌激素樣作用。

[關(guān)鍵詞] 乳腺癌MCF-7細(xì)胞；生精湯；細(xì)胞增殖

[中圖分類號(hào)] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）17-0129-03

多囊卵巢綜合征（PCOS）是婦科臨床常見的內(nèi)分泌失調(diào)性疾病，近年來發(fā)病率呈上升趨勢[1]。中醫(yī)中藥從整體觀念出發(fā)，治療本病有獨(dú)特優(yōu)勢。生精湯即為經(jīng)過多年臨床證明能有效治療多囊卵巢綜合征的中藥復(fù)方[2，3]，由菟絲子、淫羊藿、女貞子、補(bǔ)骨脂等藥配伍而成。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，生精湯中的組成中藥如菟絲子[4]、淫羊藿[5]、女貞子[6]等提取物均具有雌激素樣作用，提示本方可能是通過雌激素樣作用來對(duì)抗多囊卵巢綜合征中的雄激素過多，調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸的內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，從而起到治療作用。MCF-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)即E-SCREEN法作為評(píng)價(jià)藥物雌激素活性的一種經(jīng)典方法，靈敏度高，方便快捷，其原理是根據(jù)雌激素受體（ER）陽性的MCF-7乳腺癌細(xì)胞株，可在雌激素或雌激素樣物質(zhì)的刺激下發(fā)生增殖[7]。因此，本實(shí)驗(yàn)利用ER陽性乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，觀察生精湯對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的作用，評(píng)價(jià)其植物雌激素活性，揭示其對(duì)多囊卵巢綜合征的作用機(jī)制，為指導(dǎo)臨床婦科疾病用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 生精湯由以下各味中藥組成：菟絲子、淫羊藿、女貞子、補(bǔ)骨脂、熟地、山藥、雞血藤、劉寄奴、王不留行、制香附、生麥芽，均購置于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠。

1.1.2 細(xì)胞株 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株購自于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。本實(shí)驗(yàn)室液氮保存。

1.1.3 主要試劑 陽性藥物為己烯雌酚，北京益民藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)0504100。胎牛血清（08028）購自杭州四季青生物工程材料有限公司；培養(yǎng)基RPMI1640（12100-045）為Gibco公司產(chǎn)品；噻唑藍(lán)MTT（08002）為華美生物工程公司進(jìn)口分裝產(chǎn)品；1：250胰蛋白酶（080535）為吉泰科技有限公司進(jìn)口分裝產(chǎn)品；二甲基亞砜（分析純，54186）為江蘇鴻聲化工廠產(chǎn)品；青霉素和鏈霉素來自于上海先鋒藥業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑的配制 ①D-Hanks液配制 于700 mL重蒸水中分別加入8.00 g NaCl、0.40 g KCl，0.06 g Na2HPO4·7H2O，0.06 g KH2PO4、0.35 g NaHCO3及0.02 g酚紅，定容至1 L，調(diào)pH值至7.2～7.4，分裝于小瓶后10磅30 min高壓滅菌。②胰蛋白酶溶液配置 1：250胰蛋白酶2.5 g，溶于1L經(jīng)高壓消毒滅菌的D-Hanks中， 0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，無菌條件下分裝儲(chǔ)存于-20℃冰箱備用。使用時(shí)加D-Hanks溶液稀釋成0.08%的胰蛋白酶溶液。③培養(yǎng)液配置 約300 mL三蒸水中緩慢加入培養(yǎng)基干粉，攪拌使之溶解；再將NaHCO3溶于約200 mL三蒸水后加到上述溶液中，定容至1 L，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，無菌條件下分裝保存于-20℃冰箱備用。使用時(shí)加青霉素和鏈霉素（終濃度均為100 U/mL）以及滅活新生牛血清（終濃度為10%～20%）。④抗生素液配置 青霉素和鏈霉素溶于D-Hanks溶液中，使其終濃度均為10000 U/mL， 0.22 μm微孔濾膜負(fù)壓過濾除菌后分裝儲(chǔ)存于-20℃冰箱備用。⑤PBS溶液配置 于700 mL蒸餾水中依次加入8.00 g NaCl、0.20 g KCl、1.56 g Na2HPO4·7H2O和0.20 g KH2PO4，定容至1 L，充分混勻，分裝后10磅30 min高壓滅菌。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將人乳腺癌MCF-7細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100 U /mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，在體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、37℃恒溫條件下進(jìn)行培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞生長情況，換液周期為2～3 d一次，貼壁長滿后用0.25%胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)液吹打制成細(xì)胞懸液進(jìn)行傳代，并取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)開始前4 d用PBS溶液洗滌細(xì)胞2次后，改在無酚紅RPMI-1640中培養(yǎng)，以耗盡細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的雌激素。倒置顯微鏡觀察經(jīng)生精湯作用后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。

1.2.3 藥物制備 陽性藥物：己烯雌酚用三蒸水制成30 μg/mL的懸濁液。生精湯組：按處方藥量稱取各藥材，加10倍量、8倍量水分別煎煮2 h、1.5 h，合并水煮液，并濃縮至浸膏，以三蒸水稀釋成濃度為1 mg/mL的貯存液。用無菌膜過濾器濾過除菌后，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)前加入無酚紅的RPMl-1640培養(yǎng)液（含10%FBS）中，稀釋至所需濃度。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組 分為空白對(duì)照組（細(xì)胞+培養(yǎng)基）、雌激素對(duì)照組（己烯雌酚，30 μg/mL）和生精湯全方低、中、高劑量組（分別為500，800，1 000 μg/mL）。

1.2.5 MTT法檢測生精湯對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響 用不含牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)的乳腺癌MCF-7以1×104/孔接種于96孔板，37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞60%～75%融合，將細(xì)胞分為5組，每組6復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入噻唑藍(lán)孵育4 h，棄去上清，加入二甲基亞砜150 μL震蕩10 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀于波長570 nm處測定各孔吸收值（OD值），計(jì)算平均OD值和增殖率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，單因素兩水平資料均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，單因素多水平采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察各處理因素加入后 24 h和48 h時(shí)，不同處理因素對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長狀態(tài)的影響。結(jié)果如下：空白對(duì)照組：細(xì)胞單層貼壁生長，生長舒展，僅少許細(xì)胞呈懸浮生長；胞漿飽滿、透亮，具多個(gè)突起，細(xì)胞核圓形或橢圓形。己烯雌酚組：細(xì)胞貼壁生長旺盛，輪廓清晰，胞間結(jié)構(gòu)緊密，幾乎無脫落，且胞漿飽滿，胞核圓形或橢圓形。48 h后觀察可見相鄰細(xì)胞生長緊密，成片融合。生精湯各組：細(xì)胞呈集落性貼壁生長，偶見細(xì)胞脫落懸浮生長。48 h后觀察可見：細(xì)胞輪廓清晰，胞漿飽滿，折旋光性強(qiáng)，相鄰細(xì)胞部分可見有融合，甚至可見成片生長。

2.2 MTT法觀察生精湯對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響

由表1和圖1結(jié)果可知，予己烯雌酚可誘發(fā)MCF-7細(xì)胞增殖顯著加快，與空白組比較有極顯著差異（P < 0.01）。與陽性藥己烯雌酚組比較，生精湯的低、中劑量組效果不及陽性藥，高劑量組效果與陽性藥比較差異無顯著性（P > 0.05），說明效果相當(dāng)。從增殖率上來看，生精湯高、中、低劑量組給藥均可見MCF-7細(xì)胞增殖加速，并且存在量效關(guān)系。

3 討論

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可見，生精湯高、中、低劑量組均可使MCF-7細(xì)胞增殖顯著加速，具有明顯的雌激素樣作用。究其原因，我們認(rèn)為組成生精湯中的中藥含有植物雌激素，它們與雌激素結(jié)構(gòu)相似，所以可與雌激素受體相結(jié)合而發(fā)揮一定的雌激素作用。文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)骨脂含有總香豆素如補(bǔ)骨脂素，菟絲子、淫羊藿含有黃酮類成分。這些木脂素、香豆素、黃酮類成分均為植物雌激素[8]，因此，我們也可以認(rèn)為這些化合物是生精湯具有雌激素樣作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用途徑。

植物雌激素的結(jié)構(gòu)特征與雌二醇相似，都具有一對(duì)羥基和一個(gè)酚環(huán)，所以可以與哺乳類動(dòng)物及人類的雌激素受體相結(jié)合并將其激活，該類化合物已被證實(shí)存在于多種植物中，尤其是在活血化瘀藥和補(bǔ)益藥中，而用于治療多囊卵巢綜合征的生精湯中中藥多為補(bǔ)腎活血藥。

此外，一種植物常含有不止一種甚至多種植物雌激素，因一種藥物往往不止含有一種植物雌激素，特別是中藥復(fù)方內(nèi)不同成分間的聯(lián)合作用和相互影響也應(yīng)引起人們的注意，因此檢測它們聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的效果更能反映其在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮作用的真實(shí)情況。

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（收稿日期：2013-04-18）